大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗生产工艺条件的优化

目的优化大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗的生产工艺条件。方法通过对大菱鲆鳗弧菌VAM003株培养基(TSB和LB)、培养基盐度(1. 5%、2. 0%、2. 5%、3. 0%、3. 5%NaCl)、接种量(5%、10%、15%)、发酵时间(6～12 h)进行筛选,采用最适发酵条件制备大菱鲆鳗弧菌VAM003株发酵菌液,分别加入不同终浓度的甲醛(0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 4%)灭活24、48、72 h,确定最适灭活条件。采用最适生产工艺制备2批大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗,并进行安全性及效力试验。结果大菱鲆鳗弧菌VAM003株最适发酵培养条件为:用含2. 5%NaCl的TSB培养基,在接种量10%条件下发酵培养10～12 h,活菌量达5×109 CFU/m L以上;最适灭活条件为:甲醛终浓度0. 2%灭活24 h。大菱鲆注射灭活疫苗后,全部健活,未出现临床症状,摄食、游姿及体色均正常,注射部位无红肿,内脏器官无病变;疫苗的免疫保护率达90%以上。结论成功优化了大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗规模化生产工艺条件,制备的灭活疫苗具有良好的安全性及效力,可用于大菱鲆鳗弧菌病的预防。     

鳗弧菌金属蛋白酶单克隆抗体的制备及鉴定

鳗弧菌M3胞外产物经纯化得到分子量为36.5kDa的金属蛋白酶，浓缩后作为抗原免疫BALB/C小鼠，经细胞融合及筛选。得到三株稳定分泌抗金属蛋白酶的杂交瘤细胞株。分别命名为P2B1，P4A3和P4B1。亚型鉴定结果表明，三株细胞株产生的单抗均为IgG3型。蛋白质印迹（Wes tern Blot)分析显示，所得到的单抗只与分子量为36.5kDa的金属蛋白酶反应，具有较高特异性。三株单抗均能有效抑制蛋白酶活性。     

海洋潮差区混凝土表面微生物16S rDNA分子鉴定

针对目前海洋混凝土工程的腐蚀现状,进行了海洋微生物对潮差区混凝土的作用机理及完善海工混凝土的腐蚀机理探索.通过海工混凝土潮差区部位取样,对暴露于潮差区中部22 y的混凝土试样表面进行FE-SEM、EDAX分析,结果表明:潮差区混凝土表面腐蚀严重,结构疏松,表面覆盖有有机物质和微生物.并将暴露于潮差区中部22 y的混凝土试样和该取样位置挂置7 d的混凝土试样表面的微生物群落分别分离,克隆了其中30株和12株细菌的16S rDNA基因,测定其序列且进行比对,其分别属于15个和7个种属中.优势种属均为假交替单胞菌,但随着暴露时间的增加,总细菌株数和总菌属数分别增大到2.5和2.14倍,且种属的变化也很大.同时,建立了海洋混凝土工程表面细菌鉴定方法,以及分离、鉴定的菌种为后续细菌对混凝土作用的试验提供菌种.     

泥鳅杂交F_1代与亲本的生长及形态性状比较分析

比较分析了不同生长阶段的辽河泥鳅、黄河泥鳅及其杂交代的体质量、体长、生长性状以及变异系数,建立了不同生长阶段的生长方程,并对主要生长性状进行了通径分析.结果显示,在雌性样本中杂交F_1代1龄泥鳅与辽河泥鳅和黄河泥鳅相比体长分别提高了32.99%和28.43%,2龄泥鳅分别提高了35.35%和26.15%;雄性F_1代泥鳅体高、体长、尾柄长、腹鳍鳍条数是影响体质量的主要性状;雌性F_1代泥鳅背前区长、腹鳍基部到背鳍基部、胸鳍基部到吻端、鳃盖前端上侧到臀鳍前基部是影响体质量的主要性状,上述指标是理想的泥鳅选育形态测量指标.试验结果表明,辽河泥鳅(♂)×黄河泥鳅(♀)杂交F1代在生长性状上有优势,且生长优势是长期稳定的,其形态性状偏向母性遗传.     

大菱鲆出血症病原菌的分离和鉴定

从患病大菱鲆体内分离到一株病原菌SMP1,经人工感染试验计算出SMP1的半致死量LD50 =1.94× 10 6 。药敏实验表明氟哌酸、丙氟哌酸、复合磺胺、氯霉素、四环素对SMP1有较强的抑制作用。BIOLOG细菌鉴定系统不能对SMP1鉴定。综合形态观察、生理生化特征、16SrDNA、溶血素基因保守区分析等实验结果 ,可将SMP1鉴定为鳗弧菌。     

鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究

以鳗弧菌M3和SMP1为细菌抗原制备了油乳化二价疫苗,用饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼,评价鱼的免疫应答和疫苗的保护效果.结果显示,乳化疫苗在鱼后肠刺激产生的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平均高于未乳化疫苗(P＜0.05);并且在乳化疫苗免疫的鱼血清检测到明显升高的M3抗体效价(P＜0.05).原位杂交结果显示,乳化疫苗免疫鱼的后肠IgM的产生水平高于未乳化疫苗免疫鱼.攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的鱼对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%.结果表明,鳗弧菌油乳化二价口服疫苗能引起大菱鲆后肠的非特异性和特异性免疫应答并有效地抵抗鳗弧菌的感染,适合用作水产口服鱼用疫苗.     

esaC基因对迟缓爱德华氏菌的毒力及T3SS蛋白分泌的影响

为了确定编码迟缓爱德华氏菌(E.tarda)Ⅲ型分泌系统(T3SS)装置蛋白的esaC基因的功能,采用基因敲除的方法构建了E.tarda野生型致病菌株LSFAO的esaC基因无极性缺失突变株LSE40ΔesaC,该突变株缺失了esaC的46-1452bp。Western blotting分析表明,由于esaC的缺失,E.tarda T3SS的输送器蛋白(EseB,EseC,EseD)不能分泌到细胞外,同时细菌的自凝聚现象消失;毒力检测发现,突变株LSE40ΔesaC对蓝曼龙鱼的半数致死量比野生型菌株提高了11.5倍。结果表明,esaC基因影响T3SS输送器蛋白的分泌和E.tarda的毒力。此研究确定了esaC基因作为E.tarda T3SS装置蛋白的功能,加深了对E.tarda致病机理的了解。     

一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙鲆分离到一株病原菌M4,革兰氏阴性,杆状,有极生和侧生鞭毛 ,能运动,菌落半透明.进行了常规生理生化和BIOLOG-GN细菌鉴定系统测试,结果表明菌株M4与V.carchariae的表型特征非常相似.为了进一步确定M4的分类学地位,测定了其 16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结果表明菌株M4与 V.carchariae的亲缘关系最近.综合上述结果,菌株M4可鉴定为Vibiro carchariae .     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

牙鲆红细胞免疫功能的初步研究

通过尾静脉采血收集养殖牙鲆的外周血细胞,以金黄色葡萄球菌作为吞噬原测定了外周血细胞的免疫吞噬活性.结果表明,牙鲆外周血中至少存在3种形态的白细胞具有明显的吞噬活性,吞噬指数和吞噬百分率分别为1.95±0.25和(21.1±1.4) %.首次观察到牙鲆红细胞具有较强的吞噬能力、变形能力和免疫粘附能力,表明牙鲆红细胞除具有运输O2和CO2的机能外,还具有重要的免疫防御功能.同时发现牙鲆外周血细胞的吞噬活性在不同温度下表现不同,在相对低温条件下(15℃)表现最高,与牙鲆生活的最适水温16～21℃接近,而在35℃时吞噬活性最低,表明温度会影响牙鲆血细胞的吞噬活力.