新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab')2的构建、表达和活性测定

从抗CD2 0 Fab’表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C 末端的DNA序列 ,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab’表达载体中 ,构建成抗CD2 0抗体片段F(ab’) 2 表达载体。将该载体转化宿主大肠杆菌 16C9,实现了抗CD2 0 抗体片段F(ab’) 2 在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD2 0 特异结合的F(ab’) 2 活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明 :抗CD2 0 F(ab’) 2 片段具有比Fab’更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI4 7与Daudi细胞表面CD2 0 相结合的能力 ;用MTT法检测所得到的数据说明 :F(ab’) 2 比Fab’更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab')2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab'表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C-末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab'表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab')2表达载体.将该载体转化宿主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab')2在工程菌中的可溶性分泌表达.经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F(ab')2活性片段.竞争性免疫荧光实验的结果表明抗CD20F(ab')2片段具有比Fab'更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI47与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明F(ab')2比Fab'更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长.     

抗CD3基因工程嵌合抗体片段Fab′的构建、表达和活性测定

PCR扩增抗CD3单抗轻链可变区(VL)和重链可变(VH)片段基因,将其重组到Fab ′表达载体中,构建成抗CD3嵌合抗体Fab′表达载体,转化大肠杆菌16C9进行可溶性表达 . 产物经蛋白G亲和层析柱纯化.免疫荧光竞争结合实验和3H掺入实验证实能与小鼠抗CD3 IgG HIT3a竞争性结合表达CD3的T淋巴细胞,并促进细胞增殖.     

嵌合抗CD20抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD20抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD20抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中，构建抗CD20抗体IgG的轻链和重链表达载体PK100VL和PGL05VH，并用质脂体法共转染CHO细胞，RT－PCR和ELISA检测结果证实了抗CD20抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD20抗体IgG全分子可与CD20阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。     

抗CD20嵌合抗体Fab'片段在大肠杆菌中高效表达

利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０ＳｃＦｖ表达载体上扩增重链可变区、轻链可变区基因,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ’表达载体中,构建成抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ’片段表达载体ｐＹＺＦｃｄ２０,用ｐＹＺＦｃｄ２０转化大肠杆菌１６Ｃ９,在１６Ｃ９菌中分泌表达可溶性抗ＣＤ２０Ｆａｂ’片段,经分离纯化获得具有ＣＤ２０抗原特异结合活性的Ｆａｂ’片段,竞争性竞争荧光抑制实验表明,抗ＣＤ２０Ｆａｂ’片段竞争性抑亲本属源     

嵌合抗CD20 Fab′诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD2 0基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制 ,利用3H掺入法测定嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞生长的影响 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD2 0Fab′诱导Raji细胞凋亡作用 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD2 0Fab′通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

嵌合抗CD20抗体Fab‘片段三维结构的同源模建

分别以抗CD20Fab‘轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白储备参考蛋白,利用Insight II/MSI的同源蛋白质结构模建系统（homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后,搭建成抗CD20嵌合抗体片段Fab‘的空间构象,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

抗CD3基因工程嵌合抗体片段Fab‘的构建,表达和活性测定

ＰＣＲ扩增抗ＣＤ３单抗轻链可变区和重链可变片段基因，将其重组到Ｆａｂ’表达载体中，构建成抗ＣＤ３嵌合抗体Ｆａｂ’表达载体，转化大肠杆菌１６９Ｃ９进行可溶性表达。产物经蛋白Ｇ亲和层析柱纯化。免疫荧光竞争结合实验和＾３Ｈ反故实验证实能与小鼠抗ＣＤ３ＩｇＧＨＩＴ３ａ竞争性结合表达ＣＤ３的Ｔ淋巴细胞，并促进细胞增殖。     

嵌合抗CD_(20)抗体Fab’片段三维结构的同源模建

分别以抗CD2 0 Fab’轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针 ,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白作为参考蛋白 ,利用InsightII/MSI的同源蛋白质结构模建系统(homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后 ,搭建成抗CD2 0 嵌合抗体片段Fab’的空间构象 ,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示 ,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

对一个CDR区发生突变的改形抗CD28重链单域抗体的研究

在构建改形抗CD28重链单域抗体时,得到一个具有较高免疫学活性的改形抗CD28重链单域抗体基因序列。其推导氨基酸序列与改形构建时所选的人源抗体的FRs同源性最高;其推导氨基酸序列与鼠源抗CD28半日克隆抗体重链可变区氨基酸序列比较发现,该改形抗体在CDR2区53位缺失Ala氨基酸残基,而在65a位上插入一个Arg氨基酸残基。在CDR3区缺少Asp95,Lys96,GLy97,Tyr98氨基酸残基,在FR3区缺少Lys82a,Ser82b,Leu82c氨基酸残基,由于该序列发生的突变较大,作者进一步对其进行了研究,该改形抗CD28VH单域抗体基因与人c-myc及人IgG3‘CL绞链区基因在大肠杆菌中融合表达,融俣表达包函体经复性,纯化处理后,仍具有较高与人CD28的分子结合活性。     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体的构建、表达及复性研究

构建了抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体 (scBsAb) ,在大肠杆菌中得到表达。用稀释复性 ,缓慢透析复性和凝胶过滤层析复性三种方法对scBsAb表达形成的包涵体进行复性研究表明 ,凝胶过滤层析复性能有效抑制蛋白的聚集。ELISA检测显示 ,复性后的scBsAb具有较高活性 ,能与相应抗原特异结合。     

重组治疗性乙型肝炎疫苗（YIC）的实验研究

研制了抗原-抗体复合物型乙肝治疗性疫苗。用小鼠实验证明这一治疗性疫苗的作用机理为：通过复合物中抗体Fc段与抗原呈递细胞表面的Fc受体结合,促进了细胞摄取抗原。复合物中的抗原经呈递后可比单纯抗原更有效地激活T细胞增殖,释放更多的γ-干扰素和白细胞介素-2,属TH1类型应答。复合物可在小鼠中诱生较单纯抗原诱生的抗-HBs高10倍以上。复合物还可诱生更强的细胞免疫,表现为经特异的抗原刺激后,γ-干扰素的mRNA量增多。还发现复合物可在对HBsAg低应答鼠系中（B 10.S）诱生与正常应答鼠相当的抗体效价。在HBsAg阳性转基因鼠中,复合物可使部分鼠的HBsAg转为阴性,并可产生抗-HBs,反映这一疫苗具有疗效。为制备人用乙肝治疗性疫苗建立了用重组酵母菌表达的HBsAg与人高效价抗乙肝免疫球蛋白组建治疗性疫苗的工艺,以及产品标化及效力的参比实验技术。     

联用抗口蹄疫病毒重组多肽及DNA疫苗诱发豚鼠产生特异免疫应答

选择一株O型口蹄病毒（FMDV）外壳蛋白VPI中21－40位及141－160位氨基酸残基两个抗原表位,组成串联结构141－160（20AA）－21－40（20AA）－141－160（20AA）,并与大肠杆菌β－半乳糖苷酶相连,在大肠杆菌中表达了此融合蛋白。同时将编码此融合蛋白的基因克隆进真核表达载体中,构建成重组表达质粒pCDM8FZ1。将pCDM8FZ1DNA与融合蛋白混合,免疫豚鼠一次,观察豚鼠产生免疫应答情况。结果显示,豚鼠可产生抗FMDV中和抗体及特异性T细胞增殖反应,部分豚鼠能抵抗FMDV的攻击,保护率为50％,证明将DNA疫苗与重组多肽疫苗结合起来作一次免疫,是可望用于预防FMDV感染的新途径,值得进一步探索。     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段RNEAU-1和RNEAU-2,长度均为513bp,编码171个氨基酸。以RNEAU-1为靶序列,采用RACE方法获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1,该基因包括3411bp的开放读码框,72bp的5′非翻译区(non-translated region,NTR),68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR、NBS、LRR、HD(conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。Southern杂交结果表明,SR1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT-PCR检测表明,SR1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA为模板扩增得到长度为3972bp的SR1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR1基因在GenBank上的登录号为AY193892。