苏云金芽孢杆菌cry1Aα核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aα的C端编码区截短，获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因，将其构建到植物表达载体转化烟草，研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果。T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aα核心毒素基因整合到了烟草基因组，Western杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75．6kD的核心毒素蛋白。生物测定结果表明，转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60％的致死率，对初孵甜菜夜蛾平均达到70％的致死率，最高致死率均可达到90％以上，并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用。     

苏云金芽孢杆菌cry3Aa启动子的克隆和营养期表达载体的构建

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)的绝大多数杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs)基因是在芽孢形成期（sporulation phase)表达的,而只有少数基因如cry3Aa是在营养期表达的。在本研究中,根据已知的cry3Aa基因启动子序列设计了一对引物（Ep-5s和Ep-3n),利用这对引物从拟步虫甲亚种（Bt subsp.tenebrions)中扩增出一个与预期大小（1．1kb)一致的DNA片段。序列测定及分析结果表明,这个DNA片段含cry3Aa启动子全序列,包括上游AT富含区、两个启动子区、两个SD序列及两组反向重复序列。经过一系列的克隆之后将这个片段克隆到穿梭载体pHT3101上,最后构建成一个Bt的营养期表达载体pHPT。     

转拟南芥AtNHX1基因促进烟草对钾吸收的研究

提取拟南芥总RNA,反转录合成Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1,构建了植物高效表达载体,用叶盘法将其导入烟草,经筛选获得了抗卡那霉素和GUS染色阳性的转化子38株.应用荧光定量PCR方法对转化材料部分含AtNHX1基因的烟草内源钾通道基因、烟草K 转运蛋白基因和烟草焦磷酸酶基因的转录水平进行了分析.结果表明:在转化烟草中可以检测到AtNHX1基因mRNA,与未转化材料相比,烟草钾离子转运蛋白基因NtHAK1的转录降低,H -ATPase基因NHA1转录增加,钾通道基因NKT转录无显著变化,T1代转化烟叶中K 含量显著增加,Na 、Ca2 无显著变化,烟叶中总糖含量降低,证明了编码拟南芥AtNHX1基因与植物的K 吸收有关.     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20-47)的单链抗体在转基因烟草根分泌物中的初步表达

为探索利用植物根分泌表达重组蛋白的可行性，构建了含有抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20—47)单链抗体(ScFv)基因的表达载体。该ScFv基因转化烟草后在烟草根部细胞的细胞质和内质网中获得表达。实验结果表明，5’端融合ER导向信号肽的重组ScFv可通过根分泌表达。     

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅴ基因的克隆与表达

采用RT PCR方法克隆到绿色木霉 (Trichodermaviride)AS3 371 1的葡聚糖内切酶Ⅴ (EGⅤ )的cDNA基因。测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上 ,转化酿酒酵母 ,同时研究了超声波处理对酵母完整细胞转化的影响。转化子用 2 %的 β D 半乳糖进行诱导 ,用Northern杂交和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测。结果表明 ,EGⅤ的cDNA基因开放阅读框长度为 74 1bp ,编码 2 4 7个氨基酸 ,推测的蛋白质分子量为 2 4 99kDa。超声波处理 6 0s的酿酒酵母的转化率最高 ,在相同条件下是未处理组的 2倍。酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达并分泌到胞外。发酵液中的酶活在培养 6 0小时达到最高 0 0 4 6U/ml。最适酶解温度为 6 0℃ ,最适pH值为 5 4。     

豌豆核基质结合区的功能研究

将豌豆基因组中分离的核基质结合区（Matrix attachment regions,MARs)构建在植物表达载体的T－DNA结构域中，使得报导基因β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS)基因位于两段MARS序列之间，将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经农杆菌介导转化烟草，GUS活性检测表明，MARs可以提高GUS基因的表达水平，和不包含MARs的转基因植株相比，MARs序列使GUS基因的平均表达水平提高2倍，但在瞬时表达中，MARs对GUS基因的表达没有影响。     

热诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因

利用热激启动子Hsp18.2、FLP重组酶基因及其专一识别位点构建了重组酶删除系统的植物表达载体转化烟草.热激处理后转基因植株中FLP重组酶表达并识别两个同向loxP-frt重组酶识别位点,使两位点间的DNA插入片段(包含kn1、gus、nptⅡ基因)从转基因烟草基因组中删除,由kn1基因引起的转基因烟草特殊表型及gus基因产生的蓝色表型消失.     

部分缺失的棉花曲叶病毒互补链基因启动子具有超强活性

棉花曲叶病毒（CLCuV)互补链基因启动子是一种新近鉴定的启动子,它能驱动外源基因在植物体内高效表达,为了研究其最佳启动子区域,对启动子5端进行了一系列缺失,得到5种不同长度的启动子片段与GUS基因融合的植物表达载体,继而导入根癌农杆菌,采用叶盘法转化烟草,并检测转基因植株的GUS活性,实验结果表明,自启动子5端缺失至翻译起始位点上游－287,－271时启动子活性分别是全长启动子的5倍,3倍。首次对棉花曲叶病毒互补链基因启动子的功能区进行了分析比较,发现缺失负调控元件的启动子比全长启动子具有更强的活性,平均活性是CaMV35S启动子的12倍,暗示该启动子具有应用潜力。     

东亚钳蝎昆虫毒素BmKIT的cDNA序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从东亚钳蝎的尾腺总ＲＮＡ中扩增出挛缩型昆虫毒素ＢｍＫＩＴ的ＣＤＮＡ〈并对其核苷酸序列进行了分析。将含该基因的重组分泌型表达质料ＰＥｘＳｅｃＩ－ＢｍＫＩＴ转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,表达出分泌型的融合蛋白     

转Bt＋CpTI双价基因抗虫棉铃虫性的时空表达

以转单价Bt基因抗虫棉品系中心Bt和常规棉苏棉12号对照,研究了转Bt＋CpTi双抗－1抗虫棉对棉铃虫,抗性的时空表达特征,在棉花生长发育进程中,用4－21叶位主茎叶饲喂棉铃虫初孵幼,虫,5天后观察：双抗－1和中心Bt的4－21叶上存活棉铃虫中均无3龄幼虫,苏棉12号中3龄幼虫存占活幼虫的40％以上,双抗－1和中心B棉铃虫的死亡率相近且随叶位升高而下降,分期播 抗虫性测验与各叶位抗虫性测定相似,即双抗－1和中心Bt各播种期的存活棉铃虫中没有3龄虫,苏棉12号各播种期都有3龄虫出现,双抗-1棉铃虫的死亡率与中心Bt相近,且随播种日期推迟棉铃虫死亡率逐渐升高,试验结果表明：双抗－1对棉铃虫的抗性水平与中心Bt相近,且抗性表现为前期高后期低,也对双价抗虫棉的时空表达特征与棉铃虫产生抗性的风险关系进行了讨论。     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5,对218株Bt菌株进行PCR鉴定,有51株含有vip3A类基因,其中12株为不同亚种的标准菌株,有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因,并插入表达载体pET—21b,转化大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白,表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg,对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列),杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低,说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。     

油菜叶绿体定点转化载体的构建及其杀虫性

首先从油菜叶绿体基因组克隆得到包含ｒｐｓ７基因在内的１．０ｋｂＤＮＡ片 包含ｎｄｈＢ基因在内的２．４ｋｂＤＮＡ片段,同时从苏云芽孢杆菌质粒上克隆得到一个全长３．５ｋｂ的ＢＴ杀虫蛋白基因ｃｒｙ１Ａａ。然后以ｒｐｓ７和ｎｄｈＢ基因作为同源重组片段,成功构建了包含Ｂｔ杀虫蛋白和ａａｄＡ抗壮观霉素基因的油菜叶绿体定点转化载体,并对克隆菌体总蛋白进行了生物杀虫试验。结果表明,Ｂｔ杀虫蛋白基因能够得到表达,并     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆叶中提取总ＲＮＡ，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＳｍａＩ位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为９９．５％和９８．２％。由此，构建了大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体ｐＢｉｎＳＫＴＩ。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获     

Transgenic alfalfa plants co-expressing glutathione S-transferase (GST) and human CYP2E1 show enhanced resistance to mixed contaminates of heavy metals and organic pollutants

Transgenic alfalfa plants simultaneously expressing human CYP2E1 and glutathione S-transferase (GST) were generated from hypocotyl segments by the use of an Agrobacterium transformation system for the phytoremediation of the mixed contaminated soil with heavy metals and organic pollutants. The transgenic alfalfa plants were screened by a combination of kanamycin resistance, PCR, GST and CYP2E1 activity and Western blot analysis. The capabilities of mixed contaminants (heavy metals-organic compounds) resistance of pKHCG transgenic alfalfa plants became markedly increased compared with the transgenic alfalfa plants expressing single gene (GST or CYP2E1) and the non-transgenic control plants. The pKHCG alfalfa plants exhibited strong resistance towards the mixtures of cadmium (Cd) and trichloroethylene (TCE) that were metabolized by the introduced GST and CYP2E1 in combination. Our results show that the pKHCG transgenic alfalfa plants have good potential for phytoremediation because they have cross-tolerance towards the complex contaminants of heavy metals and organic pollutants. Therefore, these transgenic alfalfa plants co-expressing GST and human P450 CDNAs may have a great potential for phytoremediation of mixed environmental contaminants.     

Tid基因对水稻的转化及转基因植株的抗虫性

利用基因枪转化法将大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)基因Ti^d转入北方推广的水稻(Oryza sativa L)品种丰优301和通887，所获得的潮霉素抗性植株通过GUS组织化学分析、PCR检测、Southern blot分子检测，证实Ti^d基因已经转入水稻基因组中，为转基因植株。用转基因水稻植株叶片进行了室内饲喂水稻二化螟(Chilo suppressalis)实验，抗虫性分析结果表明，与对照比较，部分转基因水稻植株明显地增强了对水稻二化螟虫的抗性。对转基因R1代植株进行PCR和PCR Southern分析，表明外源基因在转基因植株后代今稳定遗传。     

应用农杆菌转化水稻的研究

利用农杆菌ＬＢＡ４４０４（ＰＴＯＫ２３３）转化水稻成熟胚愈伤组织，通过筛选获得抗性伤组织并再生出转化植株，转化频率为８．９％，转基因分子生物学鉴定的阳性，外源基因ｇｕｓ在转化植株表达亦提供了转化成功的证据。转基因植株的当代及Ｔ１代植株获得了种子。摸索了应用农杆菌转化水稻的方法，条件。利用干燥处理法抑菌并提高转化植株再生频率。     

沿海甜菜的遗传转化和转基因耐盐植株的获得

以沿海甜菜丛生芽芽尖为转化受体,采用农杆菌介导法将来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶的betA基因和来自拟南芥的突变的。瓜基因转入受体细胞,通过除草剂抗性筛选、耐盐性测定和外源基因的分子检测,获得了转基因耐盐植株。PCR阳性的抗除草剂的转化小芽在分别含有1．5％、2．0％、2．5％和3．0％NaCl的培养基上进行耐盐性检测,其存活率和生物量大幅度高于未转基因的对照小芽。将移栽成活的转基因植株用盐水浇灌,转基因植株表现出比对照明显提高的耐盐性。     

转抗菌肽B基因水稻植株的获得与鉴定

构建了一个适合在水稻中表达含有抗菌肽Ｂ基因的转化载体，应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚，获得了一些转基因水稻植株。根据对选择标记基因和目的基因的分子检测和抗病性测定，证明抗菌肽Ｂ基因已整合入转化水稻基因组并在转基因水稻中表达了抗病性。