2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

发酵初期在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以调控发酵产物乙偶姻,四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的产量。随着2,3-BD添加量的增加,所产乙偶姻和TTMP的量随之增加,当2,3-BD的添加量≥4.0 g/L时,乙偶姻和TTMP的产量不再增加。同时,枯草芽孢杆菌的生物量、糖转化率也随之变化。该调控方法对枯草芽孢杆菌的分子改造菌株(Δbdh A)调控产乙偶姻和TTMP的产量影响不大。     

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg~(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。     

紫外诱变筛选低自溶高产2,3-丁二醇的地衣芽孢杆菌突变子

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为GRAS菌株,可用于大规模生产2,3-丁二醇。地衣芽孢杆菌BL41细胞自溶现象严重,导致发酵过程中生物量下降,减少了2,3-丁二醇的生成。通过紫外诱变,在筛选平板上共获得61株自溶水平较低的突变子,采用肌酸比色方法,分析了突变子合成乙偶姻的水平。在摇瓶发酵中,突变子BL41-103、BL41-196和BL41-213的2,3-丁二醇产量较高。进一步采用四联发酵罐对上述突变子发酵水平进行测定,突变子BL41-196在发酵44 h时的2,3-丁二醇产量最高,为65.1 g/L,比出发菌株BL41提高了36.0%。     

过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株,但是在2,3-丁二醇(2,3-BD)的发酵过程中,会积累较多的副产物乙偶姻(AC)。乙偶姻还原酶是催化AC合成2,3-BD的关键酶。为了提高2,3-BD合成效率,首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到B.subtilis 168,构建了重组菌B.subtilis 168/p MA5-acr。对重组菌进行摇瓶发酵实验,结果表明,相比出发菌,重组菌的2,3-BD产量和转化率分别提高28.62%和22.87%,主要副产物AC积累量下降了20.01%。同时,分支路径的副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸,也有不同程度的降低。     

山西老陈醋优良芽孢菌与醋酸菌、乳酸菌的相互作用

对分离自山西老陈醋酿造过程中的54株芽孢菌产乙偶姻、多酚、酯及不挥发性酸性能进行测定,结果显示解淀粉芽孢杆菌1539产多酚(750.96μg/mL)及不挥发性酸(2.93 g/L)的能力最强,枯草芽孢杆菌803产乙偶姻和酯的性能最强,分别为0.92 mg/mL和9.63 g/100 mL。将二者以体积比为1∶10的接种比例进行共培养,乙偶姻、多酚、总酯及不挥发性酸含量显著高于纯培养,分别为3.65 mg/mL,197.52μg/mL,8.79 g/100 mL,8.26 g/L;其中,草酸、丙酮酸、酒石酸和乳酸几种食醋中主要的不挥发性酸,分别提高了89.78%,88.32%,22.92%,32.98%,并且挥发性香气的种类和含量也显著高于纯培养。再将解淀粉芽孢杆菌1539和枯草芽孢杆菌803(体积比为1∶10)与巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19等体积比例接种进行共培养,结果表明多种菌株共培养下的乙酸乙酯、异戊酸乙酯、1-辛烯-3-醇、癸醛等山西老陈醋的特征挥发性香气成分含量显著高于各菌株纯培养。本试验为山西老陈醋发酵专用复配菌剂的开发提供了基础研究数据支持。     

乙偶姻与美拉德反应

阐述乙偶姻（3-羟基丁酮）的化学性质及其生成途径;美拉德反应的实质是羰氨褐变反应。乙偶姻是枯草芽孢杆菌发酵产物,也是美拉德反应的前驱物质。但它存在并不代表四甲基吡嗪来源于大曲中的枯草芽孢杆菌。     

优良菌株组合发酵对醋醅中川芎嗪及其前体合成的影响

该研究监测山西老陈醋醋酸发酵和熏醅过程中川芎嗪及其前体物质的变化,并对高产乙偶姻及川芎嗪菌株进行筛选及共培养,优选高产菌株组合,在醋醅模拟培养基中添加优良菌株组合联合底物及前体物质,考察其对乙偶姻和川芎嗪生成的影响。结果表明,丙酮酸、2,3-丁二醇和乙偶姻在醋酸发酵阶段呈现上升趋势,在熏醅阶段,2,3-丁二醇和乙偶姻呈下降趋势,丙酮酸含量变化不大;川芎嗪则主要在熏醅阶段生成,从熏醅第2天的6.78 μg/g急剧上升到熏醅第5天的43.52 μg/g。在醋醅模拟培养基中添加莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B15+甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）B6+丙酮酸组合,川芎嗪生成量最高,达到15.76 μg/g,比对照组提高132.79%。     

纳豆芽孢杆菌发酵液中嘌呤碱基的检测

采用反相离子对色谱法对纳豆芽孢杆菌发酵液中的嘌呤碱基进行检测,优化后的检测条件为:色谱柱,Hitachi La Chrom C18(4.6mm×250mm,5μm);紫外检测波长254nm;流动相:甲醇∶四丁基氢氧化氨∶乙酸∶水=10∶1.485∶1.485∶987.03(v/v/v/v);流速:0.7mL/min;柱温:25℃。检测结果表明该方法标准曲线良好:A、G、H、X四种嘌呤碱基的线性范围分别为0.5~20.0、1.0~50.0、1.0~50.0、0.5~20.0mg/L,相关系数均大于0.9991,方法回收率为96.9%~102.4%。基于优化后的检测方法,检测得出纳豆发酵前后发酵液中总嘌呤含量分别为41.33、84.99mg/L,说明嘌呤碱基含量在发酵过程中有所增加。     

利用絮凝及双水相萃取分离纯化发酵液中的R,R-2,3-丁二醇

针对Paenibacillus polymyxa ZJ-9一步法发酵菊芋菊粉粗提液制备R,R-2,3-丁二醇的发酵液特点,利用壳聚糖对该发酵液进行絮凝研究。结果表明,壳聚糖分子量、壳聚糖用量、助凝剂海藻酸钠用量、pH和搅拌时间分别为:43.5 kDa、0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min时,絮凝效果最佳,在此工艺条件下,发酵液中菌体和蛋白质的絮凝率分别高达89.46%和78.93%,而R,R-2,3-丁二醇保留率约为98.54%。利用双水相萃取技术对絮凝后的发酵液中R,R-2,3-丁二醇进行了分离,结果表明,异丙醇/硫酸铵双水相体系萃取效果最好,当异丙醇和硫酸铵的用量分别约为33%和30%(w/w)时,R,R-2,3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率最高,分别约为7.96和89.40%,且异丙醇/硫酸铵双水相体系能够有效萃取分离絮凝后的发酵液中不同含量的R,R-2,3-丁二醇。絮凝和双水相萃取技术分离发酵液中R,R-2,3-丁二醇具有针对性强、效率高、成本低等优点,适用于工业化生产。     

浓酱兼香型酒醅中产酱香芽孢杆菌的筛选及发酵风味成分分析

该研究从兼香型白酒不同轮次酒醅中筛选到两株碱性蛋白酶活较高并对乙醇具有较好耐受性的菌株,分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S10,其液态发酵产碱性蛋白酶活性分别可达（163.82±15.85） U/mL和（241.69±20.07） U/mL,二者均能在含体积分数6%乙醇的培养基中生长良好。菌株LS9和S10均能产生典型的酱香风味。气质分析结果表明,菌株LS9和S10发酵后代谢产生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亚麻酸等新的风味成分。菌株LS9和S10在小麦固体培养基中均具有一定的发酵产乙偶姻能力,在28 ℃恒温条件下乙偶姻产量分别为（65.15±6.15） mg/L和（41.33±4.82） mg/L,35 ℃→45 ℃→55 ℃升温培养条件下的乙偶姻产量分别为（41.21±3.27） mg/L和（26.91±2.97） mg/L。     

产3-羟基丁酮菌株的筛选及产物分析

从日本传统食品纳豆中分离筛选获得1株产3-羟基丁酮的菌株SF4-3,以葡萄糖为主要碳源,该菌株在37℃,180 r/min摇瓶培养96 h,3-羟基丁酮产量为33.90 g/L,利用气相色谱及气相色谱-质谱联用对菌株SF4-3的发酵液进行分析,结果表明主产物为3-羟基丁酮,纯度为95%以上,不产2,3-丁二酮或2,3-丁二醇。根据形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

反向高效液相色谱测定发酵液中的聚苹果酸

采用高效液相色谱柱AlltimaTMC18(4.6 mm×150 mm,4μm)上定量测定发酵生产的聚苹果酸,流动相为乙腈和0.025 mol/L磷酸二氢钾混合溶液(磷酸调pH 2.5)(V:V=5:95),流速1.0 mL/min,检测波长210 nm,柱温25℃,进样量5μL。发酵液经离心除菌体、纯沉除多糖、水解处理后进样,可以将其中的L-苹果酸完全分离定量。采用液相方法的回收率为98.70%~100.65%,RSD为0.4~1.11%。采用试剂盒的方法的回收率为96.7~97.23%,RSD为0.57~1.19%。可见,液相的精确度和试剂盒相差不大。但液相的价格相对比试剂盒要便宜很多,说明该法是测定发酵液中聚苹果酸的一种很有效的方法。     

白酒中特征手性物质的SLE-GC-MS识别方法

运用固相支撑-液液萃取(solid-supported liquid-liquid extraction,SLE)技术和手性环糊精气相色谱柱建立了白酒中乳酸乙酯的2种对映体和2,3-丁二醇的3种对映体的分析方法,采用内标标准曲线定量。结果表明,乳酸乙酯、2,3-丁二醇在各自质量浓度范围内线性关系良好,在基质样品中的平均加标回收率在80%以上,相对标准偏差为1.34%~8.50%。该方法测得D-、L-乳酸乙酯和S-、R-、meso-2,3-丁二醇的检出限分别是64.32、47.74、62.70、59.08和26.58μg/L。利用所建立方法对酱香、浓香、清香3种香型的6种市售白酒样品进行分析,目标手性对映体在所选6个酒样中含量及比例不同,并首次在白酒中分离出S-2,3-丁二醇。该方法具有高效灵敏、精密度和准确度高、易操作等特点,适用于白酒中手性物质的检测,可为利用手性识别进行白酒质量监控、原产地溯源、品质鉴定提供新思路。     

沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行发酵风味分析。通过平板分离得到4株产香较好的芽孢杆菌,并进行16S rDNA序列分析和构建系统发育树,4株菌分别为阿式芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中地衣芽孢杆菌产蛋白酶和淀粉酶能力均为最强且最适生长温度为50 ℃。以玉米粉为底物进行单菌液态发酵,采用固相萃取和气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)分析发酵液中的风味物质,一共检测到24种风味物质,其优势产物主要为3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和一些酸类等风味物质。由此而见,阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这4类菌对沉香型白酒风味的形成均具有重要作用。     

产2,3-丁二醇的酿酒酵母菌的筛选及其鉴定

酿酒酵母在自然界中广泛分布,尤其在发酵食品等领域应用广泛。2,3-丁二醇作为其利用葡萄糖发酵的产物之一,也有着极大地发展潜力。该研究利用肌酸显色法,对39株W系列菌株以及在六种不同地点分离出的菌株进行筛选,测定其乙偶姻产量,并结合形态学与分子生物学鉴定优选菌株。结果表明,菌株W141被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,发酵72 h时,2,3-丁二醇脱氢酶酶活力最高为0.025 7 U/mg,2,3-丁二醇产量最大为1.6 g/L,可作为2,3-丁二醇的生产菌株。     

采用GC×GC-TOFMS结合顶空固相微萃取技术检测枯草芽孢杆菌发酵液中吡嗪类物质

应用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪结合顶空固相微萃取技术同时检测枯草芽孢杆菌发酵液中吡嗪类物质。结果表明:标准曲线线性关系良好,相关系数r2均大于0.99,相对标准偏差在4.2%~10.9%之间,加标回收率在84%~116%之间,满足发酵液样品中吡嗪类物质定量要求。     

促酱醪发酵芽孢杆菌的筛选及应用

用酪素平板法从高盐稀态酱醪中筛选出56 株蛋白酶活性较好的菌株,牛津杯法复筛后制曲测定酶活性,得到淀粉酶活性最高的菌株CS1.11、蛋白酶活性最高的菌株CS1.13及纤维素酶活性最高的菌株CS1.17;16S rRNA序列测定结合形态学分析,CS1.11、CS1.13、CS1.17分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）;分别将3 株实验菌与对照菌枯草芽孢杆菌CS1.03单独进行制曲后盐卤发酵,发现CS1.13发酵酱油氨态氮质量浓度最高,为5.12 g/L,CS1.11发酵酱油还原糖质量浓度最高,为27.20 g/L,与其酶活性结果一致,4 株菌对酱油总酸含量影响不大;顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用内标法定性及定量分析发酵酱油发现,3 株实验菌与对照菌均具有产生吡嗪类物质及其前体乙偶姻和2,3-丁二醇的优势,且3 株实验菌优于对照菌;吡嗪类物质能赋予酱油良好的风味及健康因子,是芽孢杆菌酱油发酵的特征风味物质。筛选自高盐稀态酱醪的芽孢杆菌CS1.11、CS1.13、CS1.17有促酱醪发酵、丰富酱油风味、增进健康因子的潜力,具备良好的应用前景。     

液液萃取-气相色谱法快速测定发酵液中的己酸含量

对液液萃取-气相色谱法测定发酵液中己酸的方法进行研究。样品经硫酸酸化后采用萃取剂萃取,上层液再经微孔滤膜过滤。结果表明,乙酸乙酯为最佳萃取剂,发酵液样品最佳pH值为2。处理后样品直接进入白酒分析专用色谱柱(型号FFAP),火焰离子化检测仪(flame ionization detector,FID)检测,进样量0.6μL,以2-乙基正丁酸为内标定量。该方法加标回收效率98.19%~104.43%,相对标准偏差2.19%~3.51%,精密度3.46%,该方法精确度高、准确、可靠,可用于发酵液中己酸含量的快速定量检测。     

好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2产芽孢工艺优化

芽孢杆菌是好氧堆肥微生物菌剂的重要组成部分,为降低菌剂生产成本、改善其品质及应用效果,对芽孢杆菌产芽孢工艺进行研究。首先,在摇瓶上进行枯草芽孢杆菌GX2的培养基及培养条件优化,在此基础上,在3 L发酵罐中进行分批补料优化研究,进一步提高细胞浓度,最后,通过单因素及正交试验研究,在3 L发酵罐中对产芽孢工艺进行了优化。结果表明,当pH为6.8、温度为50℃和搅拌转速为150 r/min时,发酵液中的活菌数达1.57×10¹⁰CFU/mL,芽孢数达1.32×10¹⁰CFU/mL,芽孢率为84.1%。堆肥用枯草芽孢杆菌GX2的发酵及产芽孢工艺优化可有效提高发酵液中的活菌数及芽孢率,降低菌剂的发酵及生产成本,为后续工业化生产及应用奠定基础。