湖北省动物疫病预防控制中心《规模化猪场生物安全体系建设和疫病净化主推技术实施方案》

正一、指导思想按照“一场一案”要求,严格落实规模化猪场防疫主体责任,完善生物安全措施;采取免疫预防、监测净化、封群管理等方法,推进猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征(含高致病性)等主要动物疫病的控制和净化,逐步降低发病率,有效消除病原,最终实现“减针减负、健康养殖”的动物疫病防控新模式。     

猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为做好猪瘟的早期诊断和及时预防,建立一种快速检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的实时荧光环介导等温扩增方法。试验利用Primer Explorer version 4针对CSFV的5`UTR非编码区设计4组引物,筛选出最佳引物后建立CSFV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及适用性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法对128份临床样本和22份猪瘟活疫苗人工干扰样本的检测结果与实时荧光聚合酶链式反应检测方法一致。该方法仅对猪瘟病毒有扩增反应,且最低检测浓度为10 fg/μL,对猪伪狂犬病毒、高致病性高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等8种病原无扩增反应。本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法特异性强、灵敏度高,检测效果好,操作简单,适用于CSFV临床样本的快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA检测方法的建立

<正>猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)又名"猪蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种主要以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状及高死亡率为特征的高度接触性传染病~([1])。PRRS于1987年在美国首次发现,1991年荷兰中央兽医研究所首次分离得到病毒,我国在1996年首次报道~([2])。     

含24种乳抗体免疫乳的制备

以24株人肠道病原菌（包括病原性大肠杆菌12株、沙门氏菌8株、志贺氏菌3株、小肠结肠炎耶尔森氏菌1株）作为抗原，对乳牛进行系统免疫，免疫乳与非免疫乳乳中IgG含量无显著差异。系统免疫并不增加乳中IgG的含量，但IgG的抗体特异性大大增强，所得的免疫初乳中乳抗体对24种不同病原菌的凝集价为2^8-2^12，为普通初乳中乳抗体凝集价的32－256倍；免疫常乳中乳抗体对24种不同病原菌的凝集价为2^5-2^8，为普通乳中乳抗体凝集价的8－128倍。     

牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1的快速测定

采用免疫亲和柱－荧光光度法快速测定了牛乳及乳制品中黄曲霉毒素M1。试样经过离心、脱脂、过滤后滤液经过键合有黄曲霉毒素M1特殊抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉毒素M1具有专一的识别能力，黄曲霉毒素M1键合在分离柱中的抗体上，用甲醇与水之比为10：90的混合液将免疫亲和柱上杂质除去；以甲醇与水之比为80：20的混合液通过分离柱洗脱；加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，衍生化后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1，检测低限为0．1μg/kg；在0．1－1．0μg/kg范围内，回收率为89．6％－96．1％，变异系数为0．52％－5．8％，分析一个样品的时间小于30min，分析过程中不使用黄曲霉毒素M1标准物质，结果表明，本方法具有准确、简单、快速、安全等优点，可以满足少量和批量样品的检测需要。     

FTB多克隆抗体的研制

为建立ＦＴＢ的间接酶联免疫吸附方法，用自行制备的ＦＴＢＳ－载体蛋白结合物ＦＴＢＳ－ＢＳＡ和ＦＴＢＳ－ＨＳＡ作为免疫原，按常规免疫程序分别免疫新西兰大耳白家兔各２只，４～１０周后获得２种抗ＦＴＢ的多克隆抗体，ＰｃＡｂ－ＦＴＢ１（以ＦＴＢＳ－ＢＳＡ为免疫原）和ＰｃＡｂ－ＦＴＢ２（以ＦＴＢＳ－ＨＳＡ为免疫原）。以ＦＴＢＳ－ＩｇＧ作为标识抗原包被酶标板，建立了测定ＦＴＢ的间接酶联免疫吸附试验（ＩＣ－ＥＬＩＳＡ）方法，这２株多克隆抗体与８种真菌毒素的交叉反应均较小。     

FTB单克隆抗体的研制与特性鉴定

为建立测定ＦＴＢ的ＩＣ－ＥＬＩＳＡ方法，用复合抗原ＦＴＢＳ－ＢＳＡ和ＦＴＢＳ－ＨＳＡ作为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细胞与鼠ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４骨髓瘤细胞融合，经反复筛选，获得２株稳定分泌抗ＦＴＢ抗体的单克隆杂交瘤细胞株。免疫球蛋白亚型鉴定，１株为ＩｇＭ，１株为ＩｇＧ１。两株杂交瘤腹水的ＥＬＩＳＡ效价分别为１×１０－６和１×１０－８，用ＰＥＧ沉淀法和辛酸－饱和硫酸铵法对抗体腹水进行了纯化，并分别测定了２种单抗与ＦＴＢＳ－ＩｇＧ的亲和力常数以及与其它１１种真菌毒素的相对交叉反应，建立了测定ＦＴＢ的ＩＣ－ＥＬＩＳＡ法。     

酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测中的应用

用酶联免疫检验技术（ELISA）检测呋喃唑酮（Furazolidone）代谢物AOZ。AOZ经过16h的衍生后和酶联结合物对微孔中的抗体进行竞争反应，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理，在酶标仪上450nm处测定吸光强度。进行定性定量分析。     

免疫初乳中IgG_1和IgG_2的分离纯化

采用硫酸胺盐析、DE－52离子交换色谱、Sephacry1 S－100凝胶过滤色谱从免疫初乳分离纯化出了IgG1和IgG2,经SDS－PAGE电泳及免疫电泳证实为纯品;并对IgG1和IgG2的抗体凝集价进行了测定。     

LFA-3和IL-2对机体免疫增强作用

以绵羊红细胞膜提取的ＬＦＡ－３和猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）所产生的ＩＬ－２，同时或分别与新城疫Ⅳ系疫苗胸肌注射２２日龄雏鸡，测定鸡体ＨＩ抗体效价及Ｅｔ花环形成率的变化，结果表明，ＬＦＡ－３组抗体效价与对照组（Ｄ组）差异极显著（ｐ＜０．０１），ＩＬ－２也可显著提高ＩＶ系苗免疫后ＨＩ抗体效价（ｐ＜０．０５），且两者的作用均具有剂量依赖性。Ｅｔ花环试验结果显示，ＬＦＡ－３和ＩＬ－２两者与Ｄ组差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

应用酶免疫技术 高效进行食品安全检测

正一、酶免疫技术在食品检测中的应用酶联免疫分析法和胶体金免疫层析试纸法都属于免疫分析方法,在国外已被用于食品安全检测,我国也已在临床检验中应用多年。酶联免疫分析法是将酶催化反应放大,抗原抗体特异性相结合,以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试。酶免疫测定技术具有费用低廉、仪器简单易携、检     

非洲猪瘟病毒的快速检测方法研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种高度接触性传染病,对养猪业危害严重。世界动物卫生组织将其列为法定呈报的动物疫病,我国将其列为一类动物传染病。由于此病目前无有效疫苗进行预防,为防止疫病的传播,可靠、快速的早期诊断对于实施严格的卫生和生物安全措施必不可少。本文就非洲猪瘟的病原学检测和血清学抗体检测技术及其应用进行了综述,以期为非洲猪瘟的快速诊断提供技术参考。     

盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定

盐酸克伦特罗是一种只具有免疫反应性不具有免疫原性的小分子半抗原。本文采用重氮化法将其与牛血清白蛋白交联，用紫外扫描和SDS变性凝胶电泳方法检验。并用合成的CL-BSA免疫小鼠，经ELISA检验，小鼠产生了针对CL的抗体，表明合成的CL-BSA复合物具有免疫原性，为盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其检测试剂盒的研制奠定了基础：     

免疫初乳中乳抗体对大肠杆菌和沙门氏菌所致小鼠腹泻的被动免疫保护

以24株人肠道病原菌(包括病原性大肠杆菌12株、沙门氏菌8株、志贺氏菌3株、小肠结肠炎耶尔森氏菌1株)作为抗原，对乳牛进行系统免疫，免疫乳与非免疫乳乳中IgG含量无显著差异。系统免疫并不增加乳中IgG的含量，但IgG的抗体特异性大大增强，所得的免疫初乳中乳抗体对24种不同病原菌的凝集价为2^8-2^12，为普通初乳中乳抗体凝集价的32—256倍。采用硫酸胺盐析从免疫初乳中分离乳抗体，免疫初乳中的特异性IgG乳抗体较普通初乳中的IgG可显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长。动物试验表明，免疫乳中特异性的IgG对大肠杆菌和沙门氏菌所致小鼠腹泻具有很好的保护作用，而普通乳中非特异性的IgG则无此作用，这是由于IgG的特异性所决定。     

探讨高致病性猪蓝耳病检疫检验与防控

高致病性猪蓝耳病,系猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。病猪两耳发绀出血呈蓝紫色,俗称“蓝耳病”。它是一种由病毒引起的猪传染病。我国法定二类传染病,世界动物卫生组织(OIE)法定报告疫病。生猪一旦感染病毒后,免疫抑制,出现多种病原感染混合多发感染,继发、并发病毒性、细菌性、寄     

杭变链球菌鸡卵黄免疫球蛋白（lgY）的制备及活性检测

以远缘链球菌（S.sorbrinus 6715血清型g)免疫产卵母鸡，应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定鸡卵黄中免疫球蛋白（Immunoglobulin of Yolk,lgY)的活性，研究鸡免疫应答并制备出高免抗－S.sorbrinus lgY。结果显示出10^9cfu/只剂量免疫的母鸡，第一次免疫后的第七天卵黄中出现特异性lgY，加强免设后抗体效价上升更快，经ELISA法检测，卵黄中的抗体效价到1：384。而冷冻干燥后的lgY，其效价要超过1：2000。     

抗人大肠杆菌蛋黄抗体的分离纯化及理化性质研究

以人源大肠杆菌(ATCC23985)免疫产蛋母鸡所产免疫蛋为原料，通过蛋黄水提物制备、乙醇分级沉淀、离子交换色谱和凝胶排阻色谱对其中的免疫蛋黄抗体进行了分离纯化，并对其基本理化性质进行了分析。结果表明：蒸馏水-氯仿法是制备蛋黄水提物的最优方法，而35％的乙醇添加量能够很好地将水提物中的抗体沉淀出来。经DEAE-Sepharose柱和SephacrylS-200柱连续纯化的抗体在电泳检测时只有1个区带。研究获得的抗人大肠杆菌卵黄抗体的等电点为5.5，包含分子质量分别为65900u和24600u的2类亚基。该抗体的氨基酸组成与普通蛋黄抗体的氨基酸组成差异不大。     

免疫初乳中IgG1和IgG2的分离纯化

采用硫酸胺盐析,DE－52离子交换色谱,SephacryIS-100凝胶过滤色谱从免疫初乳分离纯化出了IgG1和IgG2,经SDS－PAGE电泳及免疫电泳证实为纯品,并对IgG1和IgG2的抗体凝集价进行了测定。     

牛初乳IgG对酸奶双菌混合发酵过程的抑制效应

研究了牛初乳IgG免疫强化对酸奶发酵前熟过程的影响。结果发现，添加外源牛乳IgG（0．85－2．125g/L）对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌双菌混合发酵产酸过程具有明显抑制效应，部分样品前熟产酸过程滞后约1h，采用琼脂单向免疫扩散法（RID）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）技术分别定量，定性分析了最终免疫强化凝固型酸奶制品中的IgG，证实普通的酸奶发酵条件（42℃，4－6h）不会导致IgG分子免疫活性的丧失.本研究推测，天然牛初乳内存在抗嗜热链球菌的IgG抗体，但仍可开发出与普通酸奶形态，风味具有可比性的牛初乳IgG免疫强化凝固型酸奶。     

高致病性猪蓝耳病的综合防制

夏秋季是高致病性猪蓝耳病的高发季节,今年防控形势依然严峻。该病目前虽未列入一类动物疫病,但如果防控不好,将严重危害养猪业的持续发展,影响农民增收和猪肉消费市场的稳定。猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合症”,是由猪繁殖与呼吸综合症病毒引起,以成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎以及仔猪呼吸异常为特征的疫病,是一种免疫抑制病,常常继发其他病原感染。去年夏秋季节,我国不少地区发生的猪“高热病”疫情,后经专家研究论证,为区别一般蓝耳病,正式定名为“高致病性猪蓝耳病”,同时,制定了针对性的防控技术规范。1临床症状与病理变化高致…