利用双标记PCR产物的量子点检测副溶血性弧菌

副溶血弧菌是一种能引起食源性疾病的重要病原菌,为了对该细菌进行检测,研制一种快速、灵敏、简便的量子点免疫层析试纸条。通过磁珠富集DNA后用双标记的特异性引物(上游引物5’用地高辛标记,下游引物5’用生物素标记)扩增不耐热溶血毒素基因(TLH),进行量子点免疫试纸条的检测。结果表明,荧光定量PCR检测磁珠(Si-MNPs)的捕获率在浓度102~106 CFU/m L均在50%以上,浓度为102 CFU/m L时达到最高捕获率(64%)。在纯培养物及模拟检测中试纸条的检测限均为4×100 CFU/m L,但在模拟检测中T线的显色强度弱于纯培养物的检测,说明鱼肉糜样本的复杂成分对检测灵敏度有一定的影响,但添加高浓度杂菌(阪崎肠杆菌、志贺氏菌)不影响该方法的特异性。方法具有特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低的特点,2 h即可完成,为副溶血弧菌的快速检测提供了有效手段。     

基于近红外免疫层析技术的食源性副溶血弧菌快速检测方法研究

建立一种应用近红外荧光免疫层析技术快速检测副溶血弧菌的方法。采用近红外荧光标记副溶血弧菌单克隆抗体,将副溶血弧菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制检测副溶血弧菌的近红外免疫层析试纸条及配套标准物质。研究表明,所建立的近红外免疫法对检测副溶血弧菌具有良好的特异性和较高的灵敏度,最低检测限为1.2×10~2 CFU/mL,与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌无交叉反应。通过效果评价试验发现,与传统检测方法相比较,所建立的近红外荧光法检测时间时间最短,检测限与RT-PCR法接近。近红外荧光法在45 min内即可完成检测,可用于食品中副溶血弧菌的高效检测,为食品安全监管提供可靠的技术支持。     

副溶血弧菌高灵敏免疫层析检测法的建立

目的建立一种简便、准确、高灵敏的检测副溶血弧菌的免疫层析方法。方法采用免疫层析结合纳米颗粒信号放大技术,利用间接法进行示踪标记:试纸条由粘贴在底板上的样品垫、含有副溶血弧菌检测抗体的结合垫2、含有荧光颗粒标记羊抗鼠IgG的结合垫1、含有检测线(捕获抗体)和质控线(羊抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜和吸水纸组成。结果结合增菌培养,该方法的检测灵敏性为10~3 CFU/g,与大肠杆菌、霍乱弧菌、河弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等无交叉反应。结论本研究所建立的检测方法具有高灵敏、特异、简便、快速等优势,具有潜在的实际应用价值。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金试纸的制备与检测

目的:制作大肠杆菌O157:H7胶体金金标试纸,检测试纸的灵敏度和特异性效果。方法:利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法检测大肠杆菌O157,并对该法进行敏感性、特异性效果进行评估。结果:该试纸可在15min内检测大肠杆菌O157,灵敏度最低检测浓度为1×106cfu/mL。对于不同的肠道菌群(沙门氏菌、单增李斯特菌、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌),未发现有交叉反应,特异性良好。结论:大肠杆菌O157:H7金标试纸检测速度快、灵敏度高,适用于快速检测。     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

近红外免疫层析法快速检测O1群小川型霍乱弧菌方法的建立与应用

目的:建立一种快速检测O1群小川型霍乱弧菌的近红外免疫层析方法。方法:利用近红外免疫层析技术,采用双抗体夹心法检测O1群小川型霍乱弧菌,制备靶向于O1群小川型霍乱弧菌的免疫层析试纸条。结果:整个检测方法在45 min内即可完成,检测O1群小川型霍乱弧菌的最低检出浓度为1×10~2 cfu/mL。特异性实验表明,该试纸条与O1群小川型霍乱弧菌样品发生特异性反应,与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌无交叉反应。与常用的胶体金方法相比,近红外免疫层析法对靶标菌的灵敏度提高了100倍。结论:新研制的O1群小川型霍乱弧菌试纸条具有特异性强、灵敏度高的特点,实验简单、方便,满足口岸现场快速检测的需要,提高检验检疫效率。     

烟草赤星病病原长柄链格孢菌快速检测胶体金试纸条的研制

为实现大田期烟叶烟草赤星病的快速测定,以胶体金标记特异性识别长柄链格孢菌的单克隆抗体,利用侧流免疫层析技术构建了长柄链格孢菌快速检测试纸条.结果表明,该试纸条对目标真菌的检出限为20 ng/mL,且与烟草相关病原体无交叉反应,灵敏度高、特异性好.利用该试纸条对加标鲜烟叶进行检测,10 min内可完成检测,操作简便快速,...     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。     

双通道荧光PCR快速检测水产品中主要致病性弧菌的研究

目的:建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌快速、敏感、特异的双通道荧光PCR同步鉴别体系.方法:针对副溶血弧菌TDH基因和霍乱弧菌ctxA基因设计合成2对特异性引物和2条Taqman探针,优化体系,建立双通道荧光PCR体系.结果:建立的双通道荧光PCR体系特异性强,引物和探针之间无干扰.对副溶血孤菌和霍乱孤菌的检测灵敏度高,下限均能达到5× 104 CFU/mL.体系稳定,重复性好,可操作性强,两种不同浓度基因组DNA无相互抑制现象,适用于不同条件、多种样品的检测.采用该方法对140份采自舟山、象山和杭州的各类水产品进行检测,副溶血弧菌和霍乱孤菌检出率分别为25.7％和3.6％,未见霍乱弧菌和副溶血弧菌混合污染的样品,表明建立的双重荧光PCR是一种可用于水产品等样品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速、灵敏、特异的鉴别方法.     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌

制备单增李斯特菌(Lm)特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,快速检测食品中Lm。所研制的胶体金试纸具有较高的特异性,不与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌同属菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌异属菌发生交叉反应;对Lm 纯培养物检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL;4℃保质期在120d 以上;对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL。该试纸具有快速、敏感、特异的优点,可用于食品中Lm 的快速检测。     

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌（英文）

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7CFU/100 m L时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_CARB-17和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃ 30 s,引物比例1:1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×102 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。     

三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因

针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×102 拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA（gDNA）为模板相当（ΔCt＜1）。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。     

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌（包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株）进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为：Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63 ℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。     

食源性致病菌快速检测方法的建立与应用

目的:建立一种快速检测空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌的多重PCR方法,并进行市场采样检测。方法:根据空肠弯曲杆菌的hipO基因、副溶血弧菌的tlh基因和小肠结肠炎耶尔森菌的Ail基因的特异性抗原基因序列,设计3对特异性引物,优化各种工作条件;测定特异性和灵敏度,建立一种多重PCR检测方法,并对泰安农贸市场采集的409份样本进行检测。结果:建立的多重PCR方法可以快速、简便地检测3种目的菌;对6种食源性致病菌的检测结果表明,该方法特异性很好,灵敏度高。空肠弯曲杆菌的检出极限为3.0×101cfu/mL,副溶血弧菌的检出极限为6.2×101cfu/mL,小肠结肠炎耶尔森菌的检出极限为1.5×101cfu/mL。样本中空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌的阳性率分别为20.8%,1.5%和13.2%。结论:采用该方法可在5h内得到检测结果,具有操作简便,检测周期短,敏感度和特异性高等优点,为进一步开发空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌快速检测试剂盒及其产业化奠定了基础。     

基于微间隙阵列电极传感器检测副溶血性弧菌的方法初探

目的建立电化学免疫传感器法快速检测副溶血性弧菌的分析方法。方法采用微间隙阵列电极作为基础电极,运用双抗夹心酶联免疫反应和酶催化银沉积反应实现分析信号放大,检测副溶血性弧菌。结果该方法特异性良好,对非目标菌株无交叉反应,对副溶血性弧菌的检出限为10~5 CFU/mL,线性范围为10~5~10~8CFU/mL,传感器的电导率与副溶血性弧菌浓度之间呈良好的线性关系,线性相关系数r~2=0.955。增菌6h后,只需2h即可完成检测。结论该方法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等特点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了一种有效手段。