破囊壶菌二十二碳六烯酸（DHA）的制备工艺及应用前景

破囊壶菌具有二十二碳六烯酸(docosahexaenvic acid,DHA)含量高、油脂组成简单、生长速率快等优点,是DHA商业开发的潜在来源。目前,破囊壶菌DHA的制备工艺还处于尝试和探索阶段,特别是破囊壶菌的发酵工艺、油脂的提取工艺和DHA的纯化工艺。该文对上述工艺的研究进展进行了综述,并对破囊壶菌DHA的产业化潜力进行了分析,为破囊壶菌DHA的工业化研究提供参考。     

响应面法优化破囊壶菌油脂的超临界CO_2萃取工艺研究

在单因素实验的基础上采用响应面法对破囊壶菌Aurantiochytrium sp.油脂的超临界CO2萃取工艺进行优化。优化的工艺条件为:萃取压力30.3 MPa、萃取温度64.4℃、CO2流速56 L/h、萃取时间2 h,在此条件下的油脂提取率达到了74.55%;油脂的主要成分为十六碳烷酸(C16∶0)和二十二碳六烯酸(C22∶6,DHA),含量分别为48.818%和35.120%。萃取出的破囊壶菌油脂成分简单,DHA含量高,可作为保健品生产的重要来源。     

破囊壶菌生产DHA的应用前景

DHA(二十二碳六烯酸)是对人体生理功能具有重要作用的一种长链不饱和脂肪酸.破囊壶菌因其DHA含量高,生长速度快而备受关注,是目前最具前景的工业化生产DHA的微生物.破囊壶菌主要通过FAS和PKS两种途径合成DHA,影响DHA合成的主要环境因素有碳氮源、温度、无机盐等.随着基因工程技术的发展,从分子水平提高DHA产量将成为可能.现就破囊壶菌生产DHA的研究现状和应用前景作一综述,为利用破囊壶菌工业化生产DHA的研究提供参考.     

破囊壶菌属微生物中超长链多不饱和脂肪酸的生物合成及其代谢工程应用

超长链多不饱和脂肪酸（VLCPUFAs）包括ARA、EPA、DHA等不但能营养机体,又具有独特生理功能而受到广泛的关注。破囊壶菌属微生物作为VLCPUFAs主要生产者,是鱼类、贝类等海洋生物富集积累VLCPUFAs的重要来源。许多研究指出,破囊壶菌具有大规模工业化生产VLCPUFAs的潜力。但是,目前对其的生物合成途径和组装机理仍未清楚。该综述从破囊壶菌属微生物的生物合成途径、储藏性脂质的组装机理和提高VLCPUFAs产量的基因工程策略三个方面进行介绍,着重对其VLCPUFAs的生物合成途径,及其油脂组装机理开展详细的介绍,并整理、结合一些较为前沿的研究发现对这些途径研究的潜在应用进行探讨,提高人们对破囊壶菌的生物合成及甘油酯组装途径的认知。研究表明,通过异源表达参与VLCPUFAs合成的基因,能在微生物工程菌和油料作物中产生EPA、DPA和DHA等功能油脂,含量能达到总脂的5%~40%,而通过基因工程敲除或改造破囊壶菌微生物的脂质合成途径基因,能提高破囊壶菌DHA产量约3%~55%。这些实例为指导VLCPUFAs的工业化生产,提供理论依据。     

培养条件对丝状微藻克里藻生长与亚油酸合成的影响

为开发亚油酸生产新资源,对筛选获得的一株丝状微藻克里藻,考察培养基氮浓度、培养基磷浓度、光强、培养温度和环境pH对其生长、氮消耗、油脂含量和油脂脂肪酸组成的影响。结果表明：培养基氮浓度对克里藻生长没有明显影响,但高氮不利于油脂和不饱和脂肪酸的合成;培养基磷浓度过低会抑制细胞生长,过高对细胞有毒害作用;适当提高光强有利于细胞生长,但对细胞内油脂含量影响不大,低光强培养有利于亚油酸等不饱和脂肪酸的合成;培养温度对克里藻生长与油脂积累影响不大,低温培养有利于亚油酸的合成;环境pH对细胞生长、油脂积累和亚油酸合成影响明显,pH 6.0～7.5的弱酸-中性条件下细胞生长最快,油脂含量更高;控制初始氮浓度3～6 mmol/L、磷浓度0.115～0.230 mmol/L、光强100～300μmol/(m²·s)、培养温度15～30℃、环境pH 7.5左右,克里藻细胞可积累42%左右的油脂,油脂中亚油酸含量在65%～75%。综上,丝状微藻克里藻是一种有潜力的亚油酸生产新资源。     

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为:葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3.6~3.9 g/L,海水晶15 g/L;在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。     

葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累

为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。     

温度对裂殖壶菌S31中FAS及PKS基因 转录水平的影响

以甘油为碳源,测定了摇瓶中裂殖壶菌S31进入脂质积累期后,温度对胞内油脂脂肪酸组成以及FAS和PKS基因转录水平的影响。结果表明:当裂殖壶菌进入脂质积累阶段后,提高发酵温度到30℃会减少藻油中DHA的含量,FAS基因的转录水平比PKS基因的更高;同时,降低发酵温度到20℃会提高裂殖壶菌S31藻油DHA的含量,PKS基因的转录水平显著高于FAS基因的。实验结果表明,温度对PKS和FAS基因的转录水平有显著的影响,从而决定裂殖壶菌S31中藻油脂肪酸组成的变化。     

不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响

研究不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响。用干重法测定裂殖壶菌的生物量,溶剂法提取油脂,并用GC分析DHA含量。结果表明:最适初始葡萄糖质量浓度和氮源质量浓度分别为80、15 g/L;菌种在26℃下培养48 h后,再将发酵温度降到22℃下培养120 h,其DHA含量为43.62%,DHA产量为5.23 g/L。在最佳条件下,50 L放大培养(先26℃培养48 h,后22℃培养96 h)后油脂产量可达14.8 g/L,DHA产量可达6.5 g/L。综上所述,裂殖壶菌具有较好的工业化生产潜力。     

破囊壶菌(Thraustochytrium)脂质的提取与分析

研究了超声波破碎破囊壶菌细胞及其脂质提取的方法 ,并对脂质脂肪酸组成进行了分析。实验结果表明 :超声波能有效破碎破囊壶菌细胞 ,从而可使脂质得率提高 6 0 % ;脂质脂肪酸组成以DHA为主 ,含量高达 6 0 %以上 ,其他多不饱和脂肪酸含量均不到 10 %。     

产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. HX2019010的筛选及其脂肪酸组成分析

为筛选产二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)菌株,从厦门市红树林的海水腐木中分离到一株球状真菌HX2019010,通过扫描电镜观察,测定ITS序列,与Genbank数据库比对,该菌株与破囊壶菌相似性较高。选取ITS序列相似性较高的相近菌株构建的进化树表明,菌株HX2019010与Aurantiochytrium类群聚为一枝,自举检验值较高,初步定名为Aurantiochytrium sp. HX2019010。该菌株在发酵罐中可产生较高浓度的DHA,98 h发酵后生物量达108.27 g/L,总油脂达28.43 g/L,DHA达9.17 g/L。细胞脂肪酸组成分析结果表明,该菌株所产脂肪酸主要为棕榈酸、DHA、肉豆蔻酸等;脂肪酸组成受培养时间或培养条件的影响,总量可达细胞干重的26.26%, 其中DHA占脂肪酸总量的32.25%-45.86%。     

利用伯克霍尔德氏菌脂肪酶富集裂壶藻油脂中的二十二碳六烯酸

目的：研究伯克霍尔德氏菌胞外脂肪酶对裂壶藻油脂中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）的富集作用。方法：用三丁酸甘油酯平板筛选法,筛选产脂肪酶的细菌;以对硝基苯月桂酸酯为底物,对筛选得到的伯克霍尔德氏菌脂肪酶的酶学性质进行研究;用该脂肪酶水解裂壶藻油脂,通过气相色谱法测定酶解后水相和有机相的脂肪酸组成来研究其对裂壶藻油脂DHA的富集作用。结果：从广州的泥土样品中分离获得一株高产胞外脂肪酶的伯克霍尔德氏菌,在产酶培养基中30 ℃、200 r/min的条件下培养40 h后,脂肪酶酶活力达到最大值70 U/mL。脂肪酶粗酶液酶活性的最适温度为45 ℃,最适pH值为8.5。该菌的脂肪酶对裂壶藻油脂中的DHA有一定的富集作用,能够使油脂中DHA占总脂肪酸的质量分数从最初的30%升高到40%。结论：筛选得到一株能够产生选择性富集DHA的脂肪酶的细菌,拓宽了可用于多不饱和脂肪酸分离纯化的脂肪酶的范围。     

菌种储藏温度及菌种活化对头孢霉脂肪酸组分的影响

为了获得高含量的二十二碳六烯酸(DHA)，对不同储藏温度对头孢霉脂肪酸组分的影响进行研究。将菌种储藏在20℃。4℃和-20℃三种温度下。比较不同储藏时间及菌种活化对菌丝脂肪酸组分的影响。结果表明菌种储藏温度、时间及发酵前菌种是否活化都影响脂肪酸组分。发酵前活化菌种。DHA含量均在10d达到最大：不活化菌种。20℃储藏菌种，DHA在20d可以达到最大：4℃，在25d可以达到最大：-20℃，在5d可以达到最大。除4℃外，其它两种温度下多不饱和脂肪酸变化和DHA变化趋势均一致。20℃，脂肪酸不饱和指数和18：3，18：2的变化与DHA变化一致。-20℃储藏菌种。如发酵前不活化菌种，其DHA，脂肪酸不饱和指数和多不饱和脂肪酸变化幅度均为六组最小。可能在这种温度下，菌丝调节脂肪酸变化的能力受到损伤。本研究可以为发酵生产多不饱和脂肪酸提供理论参考。     

萨拉米香肠发酵成熟过程中蛋白质水解及脂质氧化规律

研究萨拉米香肠从加工到发酵阶段的蛋白质及脂质水解氧化规律。结果显示,在萨拉米香肠发酵成熟过程中,蛋白质水解指数不断增加,并且在高温发酵初始及发酵15 d阶段是蛋白质水解和游离氨基酸总量累计的主要阶段。发酵45 d,游离氨基酸总量略降低但与发酵中期总量差异不显著。另外,中性脂质及游离脂肪酸相对含量显著增加（P＜0.05）,而磷脂相对含量不断降低;除油酸和鳕油酸外的不饱和脂肪酸含量在发酵成熟过程中均呈现先升高后降低的趋势,并且该趋势与脂质氧化的变化趋势相同。因此,萨拉米香肠发酵成熟过程中脂质水解及氧化的发生是同步的。     

EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

为确定一种高效、稳定的选育高产DHA裂殖壶菌菌株的方法,将出发菌株Schizochytrium sp.31进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变,并将复合诱变方法与2种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。结果显示,该复合诱变正突变率达到32.2%,远高于2种单因子诱变方法;复合诱变选育得到高产DHA裂殖壶菌菌株,其DHA生产能力和DHA含量分别达到7.2g/L和43.2%,比出发菌株分别高35.6%和19.2%;经过5代培养,其发酵指标稳定,遗传稳定性优于单因子诱变获得的菌株。该复合诱变方法是选育高产DHA裂殖壶菌菌株的有效手段,也为其它产多不饱和脂肪酸菌株的选育提供了参考。     

原生态与人工添加二十二碳六烯酸羊乳制品贮藏期脂肪酸稳定性比较

通过饲喂奶山羊富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的微藻粉，获得原生态DHA羊乳（DHA含量为30 mg/100 g原料乳），然后将其制作成超高温瞬时灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）乳及全脂乳粉，同时设立人工添加富含DHA微胶囊粉的UHT乳及全脂乳粉作为对照组，在常温（25 ℃）和高温（37 ℃）下进行为期28 d的贮藏实验，研究原生态与人工添加DHA羊乳制品贮藏期脂肪酸稳定性。结果表明，与人工添加组相比，贮藏期间原生态UHT乳及全脂乳粉的DHA含量下降速率明显减缓，在UHT乳中，人工添加组乳制品DHA含量降低率在37 ℃下最高达（40.92±3.52）%（贮藏第28天），此时原生态组DHA降低率为（36.70±4.84）%。贮藏期间，原生态与人工添加DHA的UHT乳及全脂乳粉中多不饱和脂肪酸相对含量总体均下降，且与人工添加DHA的乳制品相比，原生态组中多不饱和脂肪酸相对含量更高，更易氧化生成碳链更短的脂肪酸。此外，随着贮藏期的延长，原生态DHA乳制品组中的油脂氧化指标过氧化值和酸价上升速率明显低于人工添加DHA乳制品组。综上，本实验可为制备富含DHA的天然奶制品提供理论参考。     

光强和温度对球等鞭金藻（Isochrysis sphaerica）生长及其脂肪酸的影响

本研究测定了光照强度为16～58μmol／（m^2·s）和15～30℃条件下球等鞭金藻（Isochrysissphaerica）的生长曲线以及脂肪酸组成和含量。结果表明,在设置的光照强度范围内,光照强度越强,微藻的生长速度越快。光强对各种脂肪酸的含量影响有差异,过低和过高都不利于藻体内多不饱和脂肪酸（PolyunsaturatedFattyAcids,PU—FAs）的积累。当光强为24μmol／（m^2·s）时二十二碳六烯酸（DoeosahexaenoicAcid,DHA,C22：6n～3）的积累量最高,占总脂肪酸的11．77％。球等鞭金藻的最适生长温度在20～25℃之间,低温条件有利于不饱和脂肪酸的积累。光强20μmol／（m^2·s）、温度20℃条件下总不饱和脂肪酸（TotalUnsaturatedFattyAcids,TUFAs）含量最高,达64．99％;同样的光强,温度15℃条件下DHA占总脂肪酸的12．19％。可见适宜的光强和温度是利用球等鞭金藻收获PUFAs的关键。     

Disappearance of docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids from cultures of mixed ruminal microorganisms

Previous studies showed conflicting results regarding the ability of ruminal microorganisms to hydrogenate docosahexaenoic acid (C22:6, DHA) and eicosapentaenoic acid (C20:5, EPA). To determine the disappearance of DHA and EPA from mixed ruminal cultures, 2 ruminal in vitro experiments were conducted using graded levels of DHA and EPA. The first experiment examined DHA added at 0, 5, 10, 15, and 20 mg per culture flask. In the second experiment, EPA was added at 0, 5, 10, and 15 mg per culture flask. Docosahexaenoic acid and EPA were incubated in triplicate in 125-mL flasks, and 5 mL of culture contents was taken at 0, 12, and 24 h for fatty acid analysis by gas liquid chromatography. After 24 h of incubation, 4.1, 4.1, 4.0, and 3.3 mg of DHA disappeared from the 5, 10, 15, and 20 mg of DHA cultures, respectively. In the second experiment, 5, 8.3, and 7.1 mg of EPA disappeared after 24 h of incubation for the 5-, 10-, and 15-mg EPA cultures, respectively. Addition of DHA to cultures increased trans-C18:1 fatty acid accumulation by 105, 91, 82, and 74% for the 5, 10-, 15-, and 20-mg cultures, respectively, compared with control. The addition of EPA increased trans-C18:1 fatty acid accumulation by 56, 64, and 55% for the 5-, 10-, and 15-mg EPA cultures, respectively, compared with control. Addition of DHA and EPA to cultures caused a reduction in C18:1 n-9 and C18:2 n-6 biohydrogenation compared with control. Results from these experiments clearly demonstrate the ability of ruminal microorganism to transform DHA and EPA to other fatty acids causing their disappearance from cultures.     

杀菌温度对卤蛋脂肪氧化和品质的影响

本实验研究比较了不同杀菌温度对卤蛋脂肪氧化共轭二烯酸（conjugated dienoic acid,CDA）值、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）含量、脂肪酸组成以及色泽、质构和感官特性的影响。结果表明,当杀菌温度低于95?℃和105?℃时,分别能明显减缓卤蛋中CDA值和TBARS含量（增加幅度）的增加。随杀菌温度的升高,饱和脂肪酸（saturated fatty acids,SFA）总含量无显著变化（P＞0.05）;单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids,MUFA）总含量呈增加的趋势,当杀菌温度达到105?℃时MUFA总含量显著上升（P＜0.05）;相反,多不饱和脂肪酸（polyunsaturated?fatty?acids,PUFA）总含量随杀菌温度升高显著下降（P＜0.05）。当杀菌温度为121?℃时,PUFA/SFA比值显著降低（P＜0.05）,n-6/n-3比值最大。此外,卤蛋蛋白的L*值和b*值随杀菌温度升高呈下降趋势,a*值呈增加趋势,105?℃杀菌时蛋白的硬度、弹性、咀嚼性以及感官评价总分较高。综上,105?℃杀菌卤蛋的脂肪氧化程度较低,并能较好保持卤蛋脂肪酸的营养价值以及感官品质,这为卤蛋加工企业选择合适的杀菌温度提供了理论依据。     

Differential scanning calorimetry evaluation of oxidation stability of docosahexaenoic acid in microalgae cells and their extracts

The aim of this work was to evaluate the oxidative stability of docosahexaenoic acid (DHA) from Aurantiochytrium limacinum SR21 microalgae cells and in their lipidic extract by differential scanning calorimetry (DSC). Besides, freezing was evaluated as a strategy for microalgal DHA long‐term conservation by analysing changes in their thermal properties. As a first approach, mixtures of the most representative A. limacinum SR21‐fatty acids were evaluated in model systems. DHA and palmitic acid were the major polyunsaturated and saturated fatty acids produced by the microalgae cells, respectively. Changes in DHA/palmitic acid ratio in model systems, in cells and their lipidic extracts, were detected by DSC through shifts in the oxidation onset temperature (OOT) values. However, OOT values of cells and lipidic extracts could be also influenced by cellular compartmentalisation, carotenoids and other components presence. Freezing was not a good strategy for DHA long‐term conservation, as revealed by OOT values and thermal properties, which reflected the extensive changes that occurred during storage.