转录因子MSN2基因过表达对酿酒酵母耐受性的影响

cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化及压力抗性的获得过程中具有重要的作用。工业应用中对酵母的耐受性有很高的要求,在发酵过程中,胁迫环境如高温、高渗透压、营养饥饿和高浓度酒精毒性等不可避免,故而提高酵母菌种的耐受性,可以提高菌种的发酵性能,降低发酵过程中的能量消耗。本文构建的突变株在工业应用方面具有重要的意义。以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作筛选标记,利用胞内重组,在MSN2基因的N端加上强启动子PGK1_p以实现基因的过表达,最终通过PCR验证,成功构建突变株AY12a-msn2。对酵母进行耐受性的测定,发现AY12a-msn2不具有一定的耐高温性能。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48 h细胞存活率、CO_2失重及发酵时间。结果发现突变株AY12a-msn2酒度下降,残糖含量上升,48 h细胞存活率上升,发酵时间较长。     

MSN4基因的过表达对酿酒酵母耐受性的影响研究

以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作为筛选标记,利用胞内重组,在MSN4基因的N端加上强启动子PGK1p以实现基因的过表达,最终通过多聚酶链式反应（PCR）验证,成功构建突变株AY12a-msn4。结果表明,该突变株具有一定的耐高温性能,在55 ℃条件下热击后仍能正常生长。同时将突变株AY12a-msn4与出发菌株AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒精度、残糖、48 h细胞存活率、CO2失重及发酵时间。结果表明,突变株AY12a-msn4发酵液酒精度提高3.85%,48 h细胞存活率上升,残糖含量下降14.5%。     

TPK3基因敲除对酿酒酵母耐受性的影响

酿酒酵母是乙醇发酵时常用的微生物,在发酵过程中会受到高温、乙醇、渗透压、乙酸等胁迫环境的影响。为增强酵母对胁迫环境的耐受,该试验以AY12a为出发菌株,利用胞内同源重组,敲除编码蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）催化亚基的TPK3基因,构建TPK3基因敲除菌株AY12a-2。利用敲除TPK3基因的分子操作来调控PKA活性,以此来提升酵母耐受性。耐受性测定结果表明,该菌株的耐热击性能、耐乙酸性能及耐盐性明显优于出发菌株。发酵数据表明,AY12a-2的葡萄糖消耗量增加及CO2的失重量提升34%,乙醇产量增长了17.8%。     

BAT2缺失酿酒酵母基因工程安全菌株的构建及其杂交育种

为了获得低产高级醇基因工程安全菌株,首先将带有Cre重组酶编码基因的pGAPZA质粒转入BAT2缺失单倍体突变株A8-B和C22-B中,利用Cre/loxp系统去除G418抗性基因(KanMX),获得酿酒酵母单倍体突变株ΔBAT2a和ΔBAT2α。然后将这2株单倍体杂交成双倍体菌株ΔBAT2,该菌株具有良好的遗传稳定性。以野生菌株AY15和2株单倍体出发菌株为对照,对基因工程安全菌株进行白酒发酵试验,实验结果显示,基因工程安全菌株ΔBAT2与出发菌株相比,CO2失重高,残糖低,乙醇含量高;与野生菌株AY15相比,异丁醇、异戊醇、总高级醇生成量分别降低50.00%、33.40%和30.57%。     

酿酒酵母SOD1、SOD2基因缺失对胁迫耐受性的影响

以sod1Δ、sod2Δ、sod1Δsod2Δ酿酒酵母基因缺失菌株为遗传材料,采用休止细胞梯度生长法,分析SOD1和SOD2基因缺失对高温、乙醇毒性、高渗透压、高盐、乙酸毒性及营养饥饿胁迫条件耐受性的影响。结果显示,与野生型菌株相比,sod1Δ菌株对高温、高渗透压和乙酸胁迫的耐受性降低;sod2Δ菌株耐受性无明显变化;sod1Δsod2Δ双缺失菌株对高温、乙醇毒性、乙酸毒性、高渗透压和高盐的耐受性均下降,表明酵母超氧化物歧化酶基因与多种胁迫耐受性密切相关。     

GIS1基因对酿酒酵母耐受性的研究

该研究主要通过过表达GIS1基因来提高酿酒酵母的耐受性。在GIS1基因的N端加入强启动子PGK1p来实现GIS1基因的过表达,然后通过稀释点板实验来对比其对热激、乙醇、渗透压以及乙酸的耐受性,同时通过高温生长曲线和高温浓醪发酵测定其高温耐受性。结果表明,在相同的稀释倍数下,55 ℃热击4 min之后菌株AY12a-gis1的生长能力明显优于出发菌株,在含有5%（V/V）乙酸的平板上改造菌和出发菌耐受性相差不大,同时通过38 ℃浓醪发酵实验发现菌株AY12a-gis1的酒精度提高了3.79%,残糖略有下降,且发酵时间与亲本菌株相一致。因此通过过表达GIS1基因得到菌株AY12a-gis1,是对工业乙醇发酵有一定应用价值的优良耐逆性菌株。     

传统诱变与基因组重排技术相结合选育耐高温酿酒酵母菌株

以酿酒酵母AY12为出发菌株,采用传统人工诱变育种与基因组重排技术相结合的方法选育出耐高温且高产乙醇的酿酒酵母菌株.通过将出发菌株进行紫外诱变,获得酿酒酵母突变群体,并从中筛选出耐高温且高产乙醇的23株突变株作为正向突变文库;将该文库通过酵母高效产孢与杂交反应实现突变文库的全基因组重排,筛选得到的基因组重排最优菌LYQ-F1的高温耐受性较出发菌株AY12明显提高,且在高温模拟发酵工艺中其乙醇产量较出发菌株提高了22.1％.     

提高乙酸耐受性酿酒酵母JJJ1突变株构建及转录组学分析

目的 构建JJJ1突变株以提高酿酒酵母在发酵过程中的乙酸耐受性,提高发酵效率。方法 本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建酿酒酵母JJJ1Δ突变株,检测突变对酿酒酵母菌株的乙酸耐受性影响,基于转录组学分析突变株耐受乙酸的分子机制。结果 在含有5 g/L乙酸的液体培养基中,酿酒酵母JJJ1Δ存活率是野生型菌株的4.44倍,发酵72 h后酿酒酵母突变株JJJ1Δ的细胞生物量是野生型菌株的1.15倍,酿酒酵母JJJ1Δ的生长延滞期比野生型菌株缩短了30 h;转录组学研究表明,敲除JJJ1基因增强酿酒酵母的代谢、生物调控、膜流动性以及转运活性和电子转移活性,减少酿酒酵母细胞生理过程、细胞连接和拟核功能以及细胞结合功能。结论 敲除JJJ1基因的酿酒酵母突变株通过提高能量代谢和氨基酸合成,降低核糖体生物发生减少细胞生理活动,增强酿酒酵母菌株乙酸耐受性。     

增强海藻糖胞内积累提高大肠杆菌耐受性与乙醇产率

为提高产乙醇大肠杆菌对发酵底物和乙醇的耐受性,并提高乙醇发酵性能,以大肠杆菌B0013-1031H为出发菌株,对其海藻糖代谢途径进行改造,获得了敲除海藻糖分解途径的突变株JC31和进一步加强海藻糖合成途径的突变株JC41。突变株JC31和JC41较出发菌株都具有更高的海藻糖合成与积累能力,其中JC41的胞内海藻糖含量可达出发菌株的12倍。与出发菌株相比,突变株JC31和JC41对葡萄糖和乙醇胁迫的耐受性显著提高。进一步引入乙醇合成途径,在葡萄糖质量浓度120 g/L的发酵条件下,菌株JC31-PA表现出最优的发酵性能,其最大乙醇产量为50. 6 g/L,较对照菌株提高了5. 42%;乙醇转化率为48. 72 g/100 g葡萄糖,较对照提高了12. 67%,达到理论转化率的95%。     

ARTP诱变以及基因组重排筛选具有耐高温性能的酿酒酵母

在工业生产中,酿酒酵母进行高温发酵具有发酵速度快、发酵周期短、发酵原料黏度低、生产成本少并且更适用于同步糖化发酵工艺等优点,因此,选育耐高温的酿酒酵母菌株在工业应用方面具有重要意义。本研究以从工业菌种中分离出来的酿酒酵母AY12作为出发菌株,对其进行常压室温等离子体诱变,在37℃下进行初筛,得到150株单菌落长势较好的菌株。将其进行产孢、杂交以实现基因组重排,在37℃下进行复筛,得到137株生长性能良好的菌株。在35℃玉米水解液中发酵,进行二次复筛,从而获得具有良好发酵性能的14株菌株。最后,进行35℃同步糖化发酵,并测定每菌株的乙醇产量和残糖含量。,最终筛选出7株具有良好耐高温发酵性能的菌株,其中发酵性能最好的菌株为L-38,其同步糖化发酵完成后,乙醇产量为16.20%(V/V),较出发菌株AY12提升了8.00%,残糖含量为35.50 g/L,较AY12降低了32.38%。     

Identification of <Emphasis Type="Italic">Zygosaccharomyces mellis</Emphasis> strains in stored honey and their stress tolerance

To screen yeast with high sugar tolerance and evaluate their stress tolerance, six yeast strains were selected from 17 stored honey samples. The species were identified through 26S rRNA sequencing. Their stress tolerance was determined via the Durham fermentation method and ethanol production ability was determined via flask fermentation. The results demonstrated that all the six strains were Zygosaccharomyces mellis. Their sugar, ethanol, and acid tolerance ranges were 500–700 g/L, 10–12% (v/v), and pH 2.5–4.5, respectively. The SO₂ tolerance was 250 mg/L. Among the six strains, 6-7431 had the best stress tolerance with sugar tolerance of 700 g/L, ethanol tolerance of 12% (v/v), and acid tolerance of pH 2.5. Furthermore, the strain of 6-7431 had the highest percentage of ethanol production at the same initial sugar content as the other strains. Therefore, the selected six yeast strains would be promising fermentation yeasts for wine-making, ethanol production, or other fermentation purposes.     

冷冻面制品中耐冻藏酵母菌的筛选鉴定及性能研究

从-18 ℃的冷冻老面中分离出6株酵母菌,考察其产气性能、耐酒精能力、耐酸能力、发酵力和耐冻藏能力等指标,筛选出一株最佳菌株,并对其进行分子生物学鉴定和生长曲线测定。结果表明：菌株AY005为最佳菌株,产气效果较好,发酵力最好,面团膨胀体积最大达到250 mL;菌株AY005在-18 ℃环境下储存60 d,酵母菌仍然具有比较好的发酵活力,存活率为62.5%,表现出较好的耐冻藏能力;菌株AY005被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）;4～16 h为菌株AY005的对数生长期。该实验对耐冻藏酵母菌AY005在冷冻面制品的应用提供了一定的理论基础,其抗冻机理还有待进一步研究。     

Overexpression of vacuolar H+‐ATPase‐related genes in bottom‐fermenting yeast enhances ethanol tolerance and fermentation rates during high‐gravity fermentation

Vacuolar H⁺‐ATPase (V‐ATPase) is thought to play a role in stress tolerance. In this study it was found that bottom‐fermenting yeast strains, in which the V‐ATPase‐related genes DBF2, VMA41/CYS4/NHS5 and RAV2 were overexpressed, exhibited stronger ethanol tolerance than the parent strain and showed increased fermentation rates in a high‐sugar medium simulating high‐gravity fermentation. Among the strains examined, the DBF2‐overexpressing bottom‐fermenting yeast strain exhibited the highest ethanol tolerance and fermentation rate in YPM20 medium. Using this strain, high‐gravity fermentation was performed by adding sugar to the wort, which led to increased fermentation rates and yeast viability compared with the parent strain. These findings indicate that V‐ATPase is a stress target in high‐gravity fermentation and suggests that enhancing the V‐ATPase activity increases the ethanol tolerance of bottom‐fermenting yeast, thereby improving the fermentation rate and cell viability under high‐gravity conditions. Copyright © 2012 The Institute of Brewing & Distilling     

香蕉菠萝复合果酒双酵母发酵工艺的研究

以新鲜香蕉、菠萝汁为原料,利用葡萄酵母、安琪酵母、水蜜桃酵母、白梨酵母为发酵菌株,从发酵过程中的酒精含量、残糖含量、酵母量的情况选出最优菌株组合进行双酵母组合发酵实验,研究初始糖度、发酵温度、初始pH值、亚硫酸氢钠浓度对发酵的影响。结果表明白梨酵母(a)和安琪活性高酵母(b)以1∶3的比例发酵复合果酒质量较好,初始糖度为28%,亚硫酸氢钠为0.01%,发酵温度为12℃,pH值3.6。     

酵母菌高糖耐受机制的研究进展

在酒精浓醪发酵生产中,酵母菌在高糖度、高渗透压等恶劣环境下发酵产生乙醇的性能与其耐受机制有密切的联系。该文以酵母菌高糖耐受机制为切入点,介绍了耐高糖酵母菌的来源,高糖胁迫下酵母菌的应激反应,归纳已公开报道的与酵母菌高糖耐受机制可能有关的基因,借鉴真菌及细菌在转录组学与蛋白质组学水平上耐受性能及机制的研究,为基因水平上酵母菌高糖耐受机制的相关研究提供参考。     

高产酸本土非酿酒酵母菌株的筛选及发酵性能研究

以25株本土非酿酒酵母菌为研究对象,采用酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）10培养基及Triple M改良模拟汁初筛,并进行耐受性（乙醇、SO2、糖及pH）测定及葡萄汁发酵,筛选能够有效增加葡萄酒酸度的优良本土非酿酒酵母菌。结果表明,非酿酒酵母菌株LT1及HU4产酸性能较好,具有较好的乙醇、SO2、糖和pH耐受性,其中菌株LT1能耐受乙醇体积分数12%、糖400 g/L及pH 2.75,菌株HU4能耐受乙醇体积分数6%vol、糖250 g/L及pH 2.75。菌株LT1和HU4在葡萄汁中启酵时间较短,发酵旺盛期CO2质量损失速率均＞0.8 g/（L·h）,乳酸产量分别为0.93 g/L、1.14 g/L,乙酸产量分别为0.38 g/L、0.42 g/L,具备酿造增酸葡萄酒的潜力。     

耐高糖酵母筛选及其高糖胁迫机制的研究进展

耐高糖酵母菌在浓醪酒精发酵过程中起着重要的作用。目前,国内外对耐高酒精度酵母菌有较为广泛深入的研究,而对耐高糖酵母菌的研究还尚有不足。该文介绍了耐高糖酵母的筛选及其高糖胁迫应急机制的研究进展,并对耐高糖酵母的发展趋势进行展望,指出酒精发酵所需酵母菌应生理耐受性较好,能耐高糖度、高酒度、高渗压等,能够抵抗极端不良环境,在工业生产中能够有效提高乙醇的产量。通过筛选耐高糖酵母菌,旨在为酵母菌高糖胁迫机理的研究提供参考。