基于锁核苷酸(LNA)增敏的植烟土壤中烟草黑胫病菌定量PCR检测方法

为了快速有效地检测植烟土壤中的烟草黑胫病菌的定殖数量,以一种锁核苷酸(LNA)引物为基础,进行了植烟土壤中烟草黑胫病菌数量的定量PCR 检测方法研究。结果表明:①与普通DNA引物相比,LNA 引物提高了PCR 反应的退火温度,减少了引物二聚体和非特异性产物的形成,提高了烟草黑胫病菌分子检测的灵敏度与特异性;②定量分析检测出14 个烟草-大蒜轮作土样中烟草黑胫病菌的定殖数量为2.76×103～5.20×104个/g,且在4～5 h 内完成检测,具有较高的灵敏度和检测效率。      

烟草黑胫病菌分子生物学研究进展

烟草黑胫病是烟草主要病害之一,每年给烟草生产造成巨大损失。烟草黑胫病菌隶属于卵菌纲疫霉属。近十几年来随着分子生物学技术的迅猛发展,烟草黑胫病菌的分子生物学研究有了较大进步。本文总结了烟草黑胫病菌在病原菌起源和分类命名、全基因组序列、线粒体基因组序列和功能基因等方面的研究进展,并分析了烟草黑胫病菌在分子生物学研究方面的未来发展方向,以期为烟草黑胫病菌致病机理研究和烟草分子抗黑胫病育种提供一定的参考。     

烟草黑胫病菌研究进展(Ⅲ)

综述了烟草黑胫病菌抗甲霜灵菌株群体动态及抗性水平 ,抗药性产生的原因 ,抗甲霜灵菌株的生物学性状遗传与变异 ,甲霜灵对烟草黑胫病菌的毒性作用方式 ,烟草黑胫病菌对甲霜灵抗性的遗传稳定性 ,对甲霜灵的抗药性治理策略和核酸分子杂交技术、PCR、RAPD、RFLP、ELISA技术在烟草黑胫病菌研究中的应用以及烟草黑胫病菌毒性遗传等方面的最新研究进展。     

河南省烟草黑胫病菌群体遗传结构的SSR分析

为明确河南省烟草黑胫病菌群体的遗传结构,本研究利用SSR分子标记对来自河南省12个地区的32株烟草黑胫病菌进行分析。结果显示,6对SSR引物共扩增出24个条带,其中多态性条带23个,多态性条带比率为95.83%;Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.2132和0.3356;遗传相似系数在0.61~1.00之间,相似系数0.80水平下UPGMA聚类可将32个菌株划分为5个类群,其中类群I和类群II包括29个菌株,为优势类群;主成分分析结果与UPGMA聚类分析结果基本一致;遗传结构分析推测河南省烟草黑胫病菌群体来自于3个祖先亚群,亚群I、亚群II和亚群III在群体中所占比例分别为13.59%、46.61和39.80%;单个菌株遗传构成分析显示87.50%菌株的遗传组分几乎由单一亚群组成。以上研究结果表明河南省烟草黑胫病菌群体的遗传多样性水平较低,遗传结构也较为简单。      

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析

重组克隆ＤＮＡ用ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ双酶切得到马铃薯Ｙ病毒ＮＩｂ基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，叶盘法将ＮＩｂ基因转入烤烟品种ＮＣ８９的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、ＰＣＲ检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株ＤＮＡ中整合了外源目的基因，且表现抵抗２０μｇ／ｍｌＰＶＹＮ的侵染，ＥＬＩＳＡ分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对ＰＶＹＮ侵染具有较高抗性的转基因烟草植株。     

绵羊服装革加工工艺

１原料皮绵羊皮盐湿板。２水洗３预浸水水３００％温度２８℃乳化剂ＢＯＲＲＯＮＡ０．３％转动６０分钟。４浸水水２００％温度２８℃浸水酶ＰＦＬＬＶＩＴＣ０．３％乳化剂ＢＯＲＲＯＮＡ０．５％脱脂剂ＢＯＲＲＯＮＴ０．３％杀菌剂ＡＲＡＣＩＴＫ０．１％纯碱１．５％...     

烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

  目的  建立一种可同时检测烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）和根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）5种烟草重要土传病原菌的五重PCR快速检测方法。  方法  筛选5种病原菌的特异性引物组合,通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化,检测体系的灵敏度,并对土壤和植株样品进行测试,验证其实用性。  结果  根据青枯病菌fliC基因、立枯病菌RPB2基因、根腐病菌COI基因以及根黑腐病菌TEF1基因设计特异性引物,并结合已报道的黑胫病菌parA1基因的特异性引物,成功建立5种烟草土传病害的多重PCR检测方法。反应体系（25 μL）:Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每条引物分别0.3 μL,Rf1/Rr1每条引物各1.8 μL,TBf1/TBr1每条引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,退火温度为58℃,灵敏度可达到100 pg/μL。  结论  本研究建立的多重PCR体系能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤,为田间烟草土传病害的早期诊断提供依据。      

恩施烟区烤烟黑胫病菌致病力测定及抗性品种差异鉴定

为有效进行恩施烟区烟草黑胫病的防控,本研究采用菌丝块茎基部创伤接种法鉴定了恩施烟区烟草黑胫病菌的致病力。根据黑胫病菌菌株接种K326、红花大金元、云烟202后的AUDPC （病害流行曲线下面积）数值进行了聚类分析,将恩施烟区烟草黑胫病菌划分为I、Ⅱ、Ⅲ 3种致病型。3种致病型病原菌没有表现出典型的强、中、弱致病特性。7个抗性烟草品种对不同致病型黑胫病菌表现出抗性差异,革新3号对3种致病型菌株均表现出较好的抗性。     

烤烟品种的RAPD引物筛选

本试验筛选出了45个引物,可产生遗传多样性,其中OPA-08、OPA-16、OPC-10、OPC-12、GENMES'S 36号、78号、112号、181号引物其扩增结果稳定性好、多态性强。这些引物的RAPD扩增结果都可作为烟草烤烟品种的遗传多样性分析、基因定位及分子标记等。经凝胶电泳比较,GENMED'S 36号引物可作为烟草品种的最适宜的引物;1.8kb条带被初步认为与抗黑胫病基因相关。这些结果为以后对烟草烤烟品种在分子水平上的研究奠定了基础,加速烟草烤烟品种分子水平上的研究进程      

镰刀菌毒素与黄曲霉菌毒素的联合毒性研究—DON、NIV和AFB_1的UDS试验

用非程序ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验以研究镰刀菌毒素的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）、雪腐镰刀菌烯醇（ＮＩＶ）和黄曲霉毒素（ＡＦＢ１）的联合毒性。结果表明，这三种毒素均可造成ＤＮＡ损伤；ＤＯＮ和ＮＩＶ及ＮＩＶ与ＡＦＢ１对ＤＮＡ损伤有交互作用，产生增毒影响。     

木霉的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对18个木霉菌株进行基因组DNA多态性分析.扩增结果表明,18个引物均反映出18个菌株间的遗传多态性,供试18个木霉菌株的RAPD分析与其生防效果之间不存在相关性.引物OPA-04与OPA-13对木霉菌全基因组DNA具有特征性分子标记.聚类分析结果表明,种间的聚类分析结果与形态鉴定的结果趋于一致.以欧氏距离5.0～5.5为适宜的阀值范围,RAPD遗传标记木霉菌可以作为该菌分类的有效手段之一.     

双孢蘑菇SRAP、ISSR、RAPD标记遗传多样性和菌群分类研究

通过PCR试验,筛选能扩增清晰稳定的DNA条带的53对SRAP引物、10条ISSR引物和56条RAPD引物。SRAP、ISSR和RAPD 3种DNA分子标记扩增位点的平均多态率分别为70.21%、78.33%、61.94%。SRAP、ISSR和RAPD扩增结果用0与1表示,共获得1 046个位点的42 840个数据。采用组间距离法和Jaccard相似性系数,应用SPSS 11.0 for Windows软件进行聚类分析,构建40个双孢蘑菇样品的遗传关系树状图。当组间距离值取16时,40个双孢蘑菇品种可分为6个类群;当组间距离值取13时,40个双孢蘑菇品种被分为9个类群。     

Effects of Primers and Taq Polymerase on Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis for Typing Listeria monocytogenes From the Environment of a Shrimp Processing Plant

Ninety-nine randomly selected isolates of Listeria monocytogenes from several processing environment locations, in a shrimp processing plant, obtained during a 5-month sampling period were subjected to randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis with the use of four primers. Preliminary studies indicated that the number of DNA bands and their intensity differed greatly with respect to the commercial source of the Taq polymerase used with individual isolates. Eighteen composite RAPD types were discerned with the use of the four primers. Among these 18 composite RAPD types, type 1 comprised 14 indistinguishable isolates, and type 9 comprised 49 indistinguishable isolates. These results indicate that the shrimp processing plant was dominated by these 2 RAPD types that comprised 63.6% of the 99 randomly selected isolates.     

Effects of Primers and Taq Polymerase on Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis for Typing Listeria monocytogenes From the Environment of a Shrimp Processing Plant

Ninety-nine randomly selected isolates of Listeria monocytogenes from several processing environment locations, in a shrimp processing plant, obtained during a 5-month sampling period were subjected to randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis with the use of four primers. Preliminary studies indicated that the number of DNA bands and their intensity differed greatly with respect to the commercial source of the Taq polymerase used with individual isolates. Eighteen composite RAPD types were discerned with the use of the four primers. Among these 18 composite RAPD types, type 1 comprised 14 indistinguishable isolates, and type 9 comprised 49 indistinguishable isolates. These results indicate that the shrimp processing plant was dominated by these 2 RAPD types that comprised 63.6% of the 99 randomly selected isolates.     

RAPD和STS分子标记技术鉴定酒花品种和纯度

运用 DNA 片断的多态性分析判定酒花品种指纹,以5个随机引物成功鉴定了11个常用酒花品种,包括4个香花,5个苦花,青岛大花和 Cluster。Kirin一段多态的随机扩增多态性 DNA(RAPD)片段被转化成序列标记位点(STS),STS 扩增可以检测到青岛大花中5%的麒麟丰禄混合率。     

Identification of Aloe species by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis

Juice and integument of leaves of 3 Aloe species, Aloe vera, A. ferox and A. africana, are not allowed to be used as food according to the Pharmaceutical Affairs Law in Japan. On the other hand, whole leaves of A. arborescens can be used as food. The present study was designed to distinguish Aloe species by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. DNA was isolated from fresh and dried leaves of the 4 Aloe species. Five out of 32 different 10-mer primers examined were useful for analysis. By comparison of the characteristic bands of PCR products on agarose gel, it was possible to distinguish the 4 species. Thus, the botanical species of Aloe in commercial food products can be identified by RAPD analysis.     

Discrimination of Tsingtaodahua from Other Hop Cultivars and Its Quality Control by Molecular Analysis

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) was used for hop varietal identification, primarily to distinguish Tsingtaodahua, a fine Chinese variety. Eleven typical varieties, including four aroma hops, five bitter hops, Tsingtaodahua and Cluster, were successfully identified on the basis of 28 polymorphic RAPD bands amplified by five random primers. UPGMA analysis of RAPD data showed genetic relationship among analyzed varieties consistent with traditional hop classification. Subsequently, one specific RAPD fragment was converted to a sequence tagged site (STS) marker which can detect as little as a 5% admixture of the variety Kirin 1 in Tsingtaodahua. The RAPD and STS markers can be successfully used for Tsingtaodahua identification and quality control.     

中国猴头菇栽培菌株的系统进化研究

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)标记对7 个猴头菇之间的亲缘关系进行研究,获得了猴头菇不同菌株的DNA 指纹图谱。结果显示：14 个随机引物中有3 个随机引物的扩增产物的DNA 条带表现出明显的多态性。这3个引物共扩增出44 条带,其中36 条为多态性条带,多态性位点比率为81.81%。同时利用NTSYSpc 2.1 生物软件分析7 个供试菌株之间的遗传相似性,并绘制系统进化树。     

不同来源酿酒酵母菌株的随机扩增多态DNA分析

研究中试用了20个随机引物对16株不同来源的酿酒酵母菌株全基因组进行了随机扩增多态DNA分析,其中OPG06,OPG11和OPG20三条适宜引物具有鉴别作用,每一引物均可扩增1～10条DNA片段,大多数片段分子量大小在100～2000bp之间,共扩增出34条RAPD谱带,多态性为85.3%,获得了稳定清晰的菌株RAPD指纹图谱。RAPD分析结果表明,不同来源的酿酒酵母菌株之间的遗传相似系数在37.5%～94.1%之间,反映出较高的遗传差异性,并可通过聚类分析将16株不同来源的酿酒酵母菌株按亲缘关系的远近分为6个类群。结果表明,利用RAPD标记技术在基因水平上对酿酒酵母菌株进行分子鉴定和分型是可行的。     

白平菇不同菌株菌丝体的RAPD分析及系统进化关系的研究

本研究采用RAPD技术分析白平菇四个不同株系的DNA序列多态性,用15个随机引物对菌株基因组DNA进行PCR扩增,其中3个引物可以扩增出较好的多态性条带图谱,共产生66条清晰稳定的带。通过对供试菌株遗传相似系数的计算和系统聚类分析,构建了树状聚类图谱,在分子水平上分析了白平菇的种质遗传学差异,为白平菇菌株鉴定提供快速有效的技术和方法。