猪皮胶原蛋白抗氧化肽的分离纯化及体外抗氧化活性研究

采用碱性蛋白酶对猪皮胶原蛋白进行酶解,制备抗氧化肽。为了得到抗氧化活性高且纯度高的抗氧化肽,本实验采用多种体外抗氧化评价体系研究超滤获得的各分子质量段猪皮胶原蛋白抗氧化肽的体外抗氧化活性;依次采用离子交换色谱、凝胶色谱对猪皮胶原蛋白酶解液进行分离纯化。结果显示:超滤分离获得5~10ku的抗氧化肽较其他分子量范围的抗氧化肽具有较好的抗氧化活性;采用离子交换色谱、凝胶色谱两种分离方法分步分离能达到较好的分离纯化效果,离子交换色谱分离得到7个组分,其中组分P1对O-2·清除率最高,多肽浓度为0.85mg/mL时,清除率为46.30%,IC50值为1.24mg/mL;该组分经过凝胶色谱分离后得到2个组分,其中组分P1-B对O-2·清除率最高,多肽浓度为0.9mg/mL时,清除率为49.43%,IC50值为0.98mg/mL。     

猪股骨头胶原蛋白降血压肽的分离纯化

依次采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对猪股骨头胶原蛋白进行酶解,制备降血压肽。为了得到高活性、高纯度的降血压肽,依次采用超滤、离子交换层析、凝胶层析对酶解液进行分离纯化,采用体外检测方法测定各分离产物对血管紧张素转化酶活性的半抑制浓度（IC50值）。结果显示：猪骨酶解液经超滤分离获得分子质量小于5 ku的组分对血管紧张素转化酶的抑制活性最高,IC50值为1.400 2 mg/mL;该组分进行离子交换层析分离得4个组分,其中组分2的活性最高,IC50值为0.488 4 mg/mL;再将组分2进行凝胶层析分离得4 个组分,其中组分2-2的活性最高,IC50值为0.195 3 mg/mL。     

裸燕麦球蛋白酶解液的纯化及其抗氧化研究

通过Osborne法制得的裸燕麦球蛋白,利用碱性蛋白酶对其进行酶解,采用Sephadex G-25凝胶层析对酶解液进行纯化及其分子质量测定,然后对各分离组分清除 ·OH、O2－ ·、DPPH自由基能力进行研究。结果表明：酶解液经分离纯化得到图谱为2个峰,分别为组分I(分子质量10738～133929D)和组分II(分子质量114～861D)。测得组分II清除 ·OH(IC50 0.589mg/mL)、O2－ ·(IC50 1.783mg/mL)、DPPH自由基(IC50 0.095mg/mL)能力高于组分I和酶解液。     

凝胶层析法分离猪股骨降血压肽及其体外稳定性

将猪股骨酶解液超滤分离后,对分子质量小于5 kD的酶解滤液（IC50值为1.362 mg/mL）进行凝胶层析分离,研究洗脱液、流速、上样量3 个因素对猪股骨降血压肽分离纯化效果的影响。结果表明：以去离子水为洗脱液,流速0.6 mL/min,上样量体积分数1%时,能够得到最佳分离效果,其最高活性组分IC50值达到0.401 6 mg/mL。研究凝胶层析分离后抑制率最高的组分的稳定性,发现其有较好的耐热和耐酸碱、耐盐性,在pH 2～6中有良好的溶解性。     

三斑海马蛋白ACE抑制肽的制备及其二级结构的研究

以三斑海马为原料,经碱性蛋白酶酶解,获得富含血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽的酶解液。酶解液经透析、Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱得到进一步分离纯化。结果表明,透析产物的IC50值为(0.44±0.26)mg/mL,相比酶解液(0.81±0.12)mg/mL,其ACE抑制活性更强。透析产物经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化后,得到3种组分,其中组分F2的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.11±0.08)mg/mL。F2经反相高效液相色谱进一步分离后,得到6个具有ACE抑制活性的组分峰,其中组分F2-4的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.005 7±0.000 9)mg/mL。经过3步分离纯化后,成功从三斑海马蛋白中分离得到一种活性较强ACE抑制肽:ProAla-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala(PAGPRGPA),多肽分子量为721.39 Da。圆二色谱分析多肽二级结构表明其主要含无规则卷曲。因此,从三斑海马蛋白中分离得到的多肽可能成为营养保健品和抗高血压药品及相关疾病的一种有益成分,且对海马蛋白资源的开发利用具有重要意义。     

青鱼肉活性肽的制备及其抗肿瘤活性研究

以青鱼肉为原料,经二步酶解、凝胶色谱分离纯化制备抗氧化和抗肿瘤活性肽。首先以抗氧化活性和水解度为评价指标,采用单因素和正交试验优化青鱼肉活性肽的制备工艺;然后采用凝胶色谱进行分离纯化,得到不同分子质量多肽组分并分析其氨基酸组成、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力和抗肿瘤活性。结果表明,二步酶解青鱼肉的最优酶解组合为碱性蛋白酶-复合蛋白酶,最佳制备工艺为:pH 8.00、酶解温度50℃、料液比2∶10(g∶mL)、酶添加量6000 U/g、酶解时间3 h,在此条件的二步酶解物清除DPPH自由基的半抑制浓度(half inhibiting concentration,IC 50)为9.52 mg/mL;经Sephadex G-15分离得到5个肽组分,其分子质量范围为130~1397 Da;抗氧化实验表明,组分IV具有最强的DPPH自由基清除能力,其IC ₅₀为3.17 mg/mL,为二步水解物的3倍。细胞增殖抑制实验发现,10 mg/mL组分IV对HepG 2细胞抑制率为92.54%,表明青鱼肉活性肽同时具有抗氧化和抗肿癌活性。     

核桃蛋白源血管紧张素转化酶抑制剂的分离纯化

从核桃蛋白源的胃蛋白酶水解物中分离纯化出具有高体外血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的抑制剂。利用超滤、凝胶色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化,以体外ACE抑制活性为检测指标,并用N端氨基酸测序鉴定其结构为酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸(Tyr-Glu-Pro,YEP),对筛选出的抑制剂进行体外模拟消化稳定性研究。结果表明,胃蛋白酶酶解液通过纯化所得ACE抑制剂的IC50值为0.32μg/mL,该ACE抑制剂在经过体外模拟消化后仍保持良好的ACE抑制活性。     

牛乳酪蛋白抗氧化乳基料的制备及其分离纯化

为制备具有低过敏性和抗氧化作用的牛乳酪蛋白活性肽乳基料,以水解度和·OH清除率为指标,先后采用大孔吸附树脂和凝胶过滤色谱分离、纯化酪蛋白酶解物。结果表明：胰蛋白酶和中性蛋白酶组合酶解牛乳蛋白6h,其产物具有较高的水解度(36.80%)和较好的抗氧化活性,·OH清除率的半抑制浓度(IC50)值为3.12mg/mL;酶解物通过LS106大孔吸附树脂分离、纯化后,体积分数为75%的乙醇洗脱液具有较高的抗氧化活性,其·OH清除率的IC50值为0.14mg/mL;体积分数75%的乙醇洗脱组分经凝胶过滤色谱分离、纯化后,得到4个不同相对分子质量肽段,其中抗氧化活性较强肽段的相对分子质量为355.38～854.89,其·OH清除率的IC50值为0.09219mg/mL,与酶解物相比其抗氧化活性扩大33.84倍;相对分子质量小于3238.05的多肽占纯化后多肽总量的60.32%,30.09%多肽是由2～8个氨基酸组成的寡肽。牛乳酪蛋白经复合酶酶解后其抗氧化活性明显提高,过敏性明显降低,喷雾干燥后可以直接制备乳基料。     

酶解玉米胚芽粕制备ACE抑制肽的条件优化

采用碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并以ACE抑制率为指标,在单因素的基础上,通过L9(34)正交试验来确定酶解的最佳工艺条件。最佳酶解条件为:底物浓度5%(w/v)、加酶量3%(w/w)、温度60℃、pH 8.5、水解时间2.5 h,在此条件下,水解物对ACE抑制作用最强,抑制率可以达到86.38%(此时水解度为22.76%)。以截留分子量为6KDa的超滤膜分离该水解物,测定两组分的ACE抑制活性。酶解液经超滤后组分Ⅱ(M6 kDa)的IC50值达到1.38 mg/mL,优于未超滤的酶解液的IC50值(3.16 mg/mL)。     

坛紫菜降血压活性肽的分离纯化及分子质量测定

用AS.1398 中性蛋白酶酶解制备坛紫菜(Porphyra haitanesis)ACE 抑制肽,并经超滤膜、Sephadex G-15 凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,纯化产物测定其氨基酸组成,并运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量。结果显示：坛紫菜酶解液经超滤分离获得分子质量小于2000D 的组分ACE 抑制活性最高,IC50 为0.73mg/mL;该组分进行Sephadex G-15 凝胶层析分离得6 个组分,组分E 的IC50 最小,为0.67mg/mL。组分E 经RP-HPLC 分离得峰6 对ACE 的抑制率最高,达到89.54%;峰6 再次过RP-HPLC,又洗出2 个蛋白峰,说明峰6 并不是单一物质,还需进行多次反复纯化。测定峰6 的氨基酸组成主要含有Tyr、Val 和Phe,同时采用MALDI-TOF-MS 分析发现有8 个主要的质子峰,信号最强的质子峰为m/z 861.17,有4 个峰聚集在m/z 860 左右,说明峰6 平均分子质量大约为860D,推算出紫菜降血压肽含有3 个Val、2 个Phe、1 个Tyr,N 端为Val,可能的排序顺序有18 种。     

蚕豆蛋白酶解物分离纯化及降胆固醇活性

采用凝胶过滤色谱对经过大孔吸附树脂纯化的蚕豆蛋白酶解物进行分离纯化,以期得到高降胆固醇活性的酶解物组分。结果表明:单因素试验得到蚕豆蛋白酶解物凝胶过滤色谱最佳分离纯化工艺条件为Sep G-10、G-25葡聚糖凝胶为柱填充材料,10 mg/m L的酶解液上样量4 m L,洗脱剂为去离子水,洗脱流速1 m L/min。凝胶过滤色谱分离纯化后得到F1~F6 6个蚕豆蛋白酶解物组分;与10 mg/m L考来烯胺散阳性对照比较,F3、F6组分对3种胆酸盐(胆酸钠、甘氨胆钠酸、牛磺胆酸钠)抑制率均高于阳性对照,其中F6组分的相对抑制率最高,分别为(274.98±0.19)%、(140.22±0.20)%、(130.99±0.22)%。     

麦胚降血糖肽的分离纯化及鉴定

建立麦胚降血糖肽的分离纯化方法及鉴定活性多肽的结构组成。采用胰蛋白酶酶解麦胚蛋白,得到降血糖多肽,并进行降血糖动物实验。超滤获得高活性组分,离子交换吸附实验选择最佳的树脂,并对麦胚降血糖肽进行离子交换吸附分离,SephadexG-25和SephadexG-15分离,再经过反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）分离高活性成分。最后采用高效液相色谱-电喷雾-质谱（HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS）鉴定活性多肽的结构组成。结果显示酶解麦胚蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制性IC50为10.98?mg/mL,能够缓解糖尿病小鼠的症状。超滤获得分子质量小于5?kDa的高活性组分,IC50为1.60?mg/mL。732型阳离子交换树脂的分离效果最好,2.5%氨水的洗脱率为98.13%,通过动态离子交换吸附分离后,活性显著提高,IC50为0.30?mg/mL。通过SephadexG-25和SephadexG-15分离得到高活性组分,经RP-HPLC分离得到8?个组分（峰）,其中1号峰的活性和含量都最高,IC50为0.098?mg/mL。HPLC-ESI-MS结果显示m/z?274.45的丰度比较高,经离子碎片拼接,共有7?种多肽,其中二肽有1?种,三肽有6?种。本研究对于开发具有降血糖功效的新型功能性食品有一定的作用。     

玉米环二肽（组氨酸-脯氨酸）的分离纯化、结构鉴定及其生物活性

环二肽（组氨酸-脯氨酸）（cyclo (His-Pro),CHP）是一种活性环二肽,在降血糖、抗氧化方面具有显著效果。实验通过DE-52阴离子交换层析、Sephadex G-25凝胶层析、半制备型高效液相色谱等方法,对高温高压环化后的玉米蛋白水解物进行分离纯化研究,得到CHP。采用超高效液相色谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱对产物的结构进行鉴定,并通过体外降血糖和抗氧化实验初步测定了其生物活性。结果表明：采用本研究的分离纯化方法制备得到的CHP的纯度为97.36%,傅里叶变换红外光谱和核磁共振波谱的测定表明该肽的结构与预期结构相符,初步的生理活性鉴定结果表明,玉米CHP经分离纯化后对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性具有很强抑制能力,半抑制浓度（IC50）分别为1.1、1.9 mg/mL;且具有很强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（IC50 67 μg/mL）和还原力。     

中华真地鳖抗氧化肽的分离及其抗氧化活性的研究

以中华真地鳖酶解物为原料,分离抗氧化肽,并对其抗氧化活性进行研究。采用DEAE-SephadexA50离子交换层析分离中华真地鳖抗氧化肽,得到FⅠ、FⅡ、FⅢ3个组分。其中FⅡ组分对O2-·自由基、OH.自由基、DPPH.自由基的清除能力最强,清除率分别为86.83%(10mg/mL)、92.28%(0.7mg/mL)、68.06%(1.8mg/mL),其半抑制质量浓度(IC50)分别为5.98、0.27、1.09mg/mL。利用高效液相分离FⅡ组分,以0%～30%乙腈为流动相,在进样量1mg时分离效果较好。