芹菜素对黄嘌呤氧化酶活性的抑制机理研究

利用紫外、荧光光谱法和圆二色谱法结合分子对接技术探讨芹菜素对黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)催化活性(底物黄嘌呤)抑制作用机理。结果表明:芹菜素具有明显可逆的混合竞争型抑制XO作用,其半数抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki)分别为8.63、2.35μmol/L;芹菜素主要通过疏水作用力与XO形成基态复合物,并引起XO二级结构(α-螺旋含量增加)发生改变;分子对接结果显示芹菜素通过结合到XO的活性空腔,并与周围氨基酸相互作用,占据疏水通道,从而抑制XO活性。     

阿魏酸对黄嘌呤氧化酶的抑制机理

为系统地探讨阿魏酸抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)活性的分子机制,采用酶学和光谱学方法测定了阿魏酸对XO抑制可逆性、抑制动力学、结合性质及结构的影响,采用分子模拟技术预测了阿魏酸与XO的结合构象。结果表明:在混合竞争的方式下,阿魏酸能可逆地抑制XO活性,抑制常数为4.5μmol/L,与咖啡酸、对香豆酸、绿原酸和没食子酸相比,阿魏酸对XO的抑制能力最强,其半抑制浓度为116.2μmol/L。荧光滴定实验结果表明:阿魏酸通过动态静态混合猝灭方式使XO荧光减少,其中静态猝灭占主导,且与XO存在一个结合位点,结合常数为3.38×10⁴L/mol(298K)；ΔG<0、ΔH<0和ΔS>0,表明该结合过程主要是以氢键和疏水作用力驱动且自发进行。分子对接结果揭示了阿魏酸进入了XO中黄素腺嘌呤二核苷酸活性区域,影响XO正常催化过程。同步荧光光谱和圆二色光谱实验表明:阿魏酸能改变XO的二级和三级结构,使XO中酪氨酸和色氨酸残基周围极性增加及疏水性降低,并且α-螺旋含量升高,β-折叠含量降低,使XO二级结构趋于紧密,这是影响XO活性的另一原因。研究以期为阿魏酸作为XO抑制剂改善高尿酸血症提供一定的理论依据。     

草豆蔻中的山姜素与血红蛋白的相互作用

利用多种荧光光谱法、紫外光谱法并结合分子模拟等方法,表征模拟生理条件下草豆蔻中的主要活性组分山姜素（alpinetin,Alp）影响牛血红蛋白（bovine hemoglobin,BHG）的结构信息,探讨Alp与BHG的作用机制。重叠光谱数据证实,Alp与BHG的相互作用符合Förster非辐射能量转移,据此依据不同的作用机理,获得3 种温度（299、309、319 K）条件下的键合常数（猝灭机理为5.880×104、4.337×104 L/mol及4.935×104 L/mol;增敏机理为3.239×103、5.225×103 L/mol及7.692×103 L/mol）及热力学常数（ΔS：182.073 J/（mol·K）,ΔH：34.320 kJ/mol,ΔG：－20.119（299 K）、－21.940 kJ/mol（309 K）及－23.760 kJ/mol（319 K））;分子模拟表明,Alp键合位点于BHG分子的疏水腔内,并与BHG的键合模式主要是疏水作用;荧光偏振显示,Alp与BHG结合后生成的配合物弛豫时间较短,结合的较松;同步荧光及紫外光谱证实,Alp的存在影响了BHG的微环境;二维及三维荧光光谱表明,Alp可以猝灭BHG的内源荧光,使其构象发生变化。结论表明,BHG对Alp有较强的结合能力,提示BHG对Alp在一定程度上可起到贮存和转运的作用。另外,考察了几种共存金属离子对Alp与BHG相互作用的影响,表明加入共存离子后的键合常数均有较大增加。     

槲皮素对酪氨酸酶的抑制作用与分子机理

本文以L-多巴为底物,采用酶抑制动力学法研究了槲皮素对酪氨酸酶的抑制作用大小及类型,并采用荧光光谱技术分析其与酪氨酸酶的猝灭作用类型、结合位点、作用力类型。在此基础上,进一步利用柔性分子对接技术分析槲皮素对酪氨酸酶的抑制机理。结果表明,槲皮素对酪氨酸酶具有抑制作用,抑制常数KI为36 m M,以竞争性抑制剂形式抑制酪氨酸酶活性,是一种可逆性抑制剂;槲皮素以1:1比例通过氢键和疏水作用力结合于酪氨酸酶活性中心,且对酪氨酸酶的荧光产生静态淬灭作用,具有氢键及疏水作用力;分子对接结果验证了以上实验结论:槲皮素占据了酪氨酸酶活性中心,且与活性中心部位的Asn260和Gly62残基形成了强烈的氢键作用,同时伴有疏水作用共同稳定复合物的结构。     

一磷酸腺苷与肌动球蛋白相互作用的荧光光谱研究

目的：采用荧光分光光度法研究了一磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate,AMP）与肌动球蛋白相互作用的情况。方法：根据分子间的相互作用力与相关热力学参数间的关系,结合AMP与肌动球蛋白相互作用的焓变和熵变,讨论AMP对肌动球蛋白荧光的猝灭机理,测定AMP与肌动球蛋白的猝灭常数、结合常数和作用力类型,考察AMP对肌动球蛋白构象的影响。结果：Western blotting证明了不同浓度AMP对肌动球蛋白解离的促进作用;AMP与肌动球蛋白结合反应中ΔG＜0,ΔH＞0,ΔS＞0,两者之间结合主要通过疏水相互作用,且AMP的存在使得肌动球蛋白的构象发生变化,疏水环境极性降低;荧光光谱分析表明AMP与肌动球蛋白的结合使肌动球蛋白内源荧光发生了有规律的猝灭,298 K和313 K温度条件下AMP与肌动球蛋白的静态猝灭常数分别为8.70×102、4.07×102 L/mol,结合常数KLB分别为9.253×102 L/mol和3.142×102 L/mol。结论：AMP通过疏水相互作用力和肌动球蛋白形成复合物,从而促进肌动球蛋白的解离。     

β-乳球蛋白与丙烯酰胺的相互作用研究

为了研究β-乳球蛋白对丙烯酰胺的抑制情况,文章采用液质联用和分子对接手段探究两者相互作用的可能性及其结合位点。研究结果表明,β-乳球蛋白会一定程度上抑制丙烯酰胺的含量,且浓度越大抑制率越高;对接结果表明二者存在相互作用的可能性,其复合物最佳的吉布斯自由能为-3.6 kcal/mol,此时丙烯酰胺结合在β-乳球蛋白内部由氨基酸残基Leu46、Leu54、Ile56、Val92、Val94、Leu103、Phe105和Leu122共同形成的柱状疏水空腔内。上述8个氨基酸残基都对丙烯酰胺均具有疏水作用,进一步实验表明Leu、Val、Ile、Phe都对丙烯酰胺有抑制作用,实验为探究β-乳球蛋白与丙烯酰胺同时被摄入时降低丙烯酰胺对人体负面影响提供了理论基础。     

荧光光谱法研究杆菌肽与溶菌酶的相互作用

利用荧光光谱法研究了杆菌肽与溶菌酶的相互作用。结果表明：杆菌肽能使溶菌酶的内源荧光发生猝灭。在不同温度下研究杆菌肽对溶菌酶的荧光猝灭作用,证明荧光猝灭机理属于二者形成复合物所引起的静态猝灭。利用Stern-Volmer方程处理实验数据,发现杆菌肽与溶菌酶具有1 个结合位点,并计算得到了不同温度下杆菌肽与溶菌酶的结合常数（KA）：3.60×105 （298 K）、1.90×105 （308 K）、4.51×104 L/mol（318 K）。通过计算热力学参数,可知杆菌肽与溶菌酶的相互作用是一个吉布斯自由能降低的自发过程,且二者之间的主要作用力类型是静电作用。三维荧光光谱实验显示,杆菌肽的加入引起溶菌酶构象的变化,表现为蛋白质内部色氨酸残基所处微环境的疏水性降低。     

荧光光谱法研究牛血清白蛋白与柠檬黄和日落黄的相互作用

用紫外-可见光吸收光谱、荧光发射光谱法研究牛血清白蛋白与柠檬黄和日落黄之间的相互作用;用Stern-Volmer方程处理实验数据,得到310 K时的动态猝灭速率常数（KQ）分别为2.51×105 L/mol和1.42×105 L/mol;用Lineweaver-Burk双倒数函数方程处理实验数据,得到310 K时静态猝灭常数（KLB）依次为5.79×105 L/mol和5.56×105 L/mol;用lg（（F0－F）/F）=lgK0+nlgρ处理实验数据,得到结合位点数（n）分别为0.556 95、0.640 56。并且两种色素在质量浓度为0～3 μg/mL范围内其含量与荧光猝灭强度具有良好的线性关系。     

5-二十一烷基间苯二酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的分子机制

小麦麸皮烷基间苯二酚可抑制α-葡萄糖苷酶活性,具有控制餐后高血糖的潜在作用,但是其作用分子机制尚未阐明。本实验采用荧光光谱、圆二色光谱以及分子对接技术研究小麦麸皮中含量最高的5-二十一烷基间苯二酚与α-葡萄糖苷酶的相互作用及抑制机制。结果显示,5-二十一烷基间苯二酚可使α-葡萄糖苷酶的内在荧光静态猝灭,不同温度(298、304、310 K)条件下结合常数K_A分别为149.8、46.2、20.3 L/mol;5-二十一烷基间苯二酚与酶分子结合降低酶分子结构中α-螺旋含量,增加β-折叠、β-转角以及无规卷曲含量;5-二十一烷基间苯二酚的苯环3—OH可与酶分子Tyr158的—COOH形成氢键,苯环5—OH的氢原子和氧原子分别与Lys156的—NH_2氢原子和Leu313的—COOH氧原子形成氢键,另外推测酶分子中Phe159、Pro312、Phe314、Asn415等氨基酸是与烷基间苯二酚形成疏水作用的重要位点。     

对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制作用及机理

为探究对羟基肉桂酸乙酯的降脂活性,本文采用酶反应动力学和分子对接技术来研究对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制类型和抑制机理。抑制动力学结果表明,对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶表现为可逆竞争型抑制（半抑制浓度IC₅₀为41.07 μg/mL）,其最大反应速率V_max为2.61 μmol/L·min,抑制常数K_i为114.35 μg/mL;分子对接结果表明,对羟基肉桂酸乙酯可以与胰脂肪酶催化三联体中的氨基酸残基Ser152和His263形成强烈的氢键作用,且通过范德华力、氢键作用力和疏水作用力与胰脂肪酶的氨基酸残基作用,与底物p-NPB竞争酶的活性中心位点。本研究为对羟基肉桂酸乙酯在降脂功能食品中的应用提供了一定的理论依据。     

双色荧光定量检测大米中的汞

利用两条部分互补的富含胸腺嘧啶（T碱基）的单链核酸,结合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ,采用同步荧光分析法,建立一种高灵敏度、高选择性的汞离子（Hg2＋）双色荧光定量检测方法。在优化条件下,Hg2＋浓度在5×10－10～500×10－10 mol/L之间时,SYBR GreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine（ROX）总的荧光强度（ΔIT）与Hg2＋浓度（C）之间具有良好的线性关系,其拟合的回归方程为ΔIT = 2.121 3C＋10.536 0,方法检出限（3σ）为2×10－10 mol/L。该方法操作简单、检测速度快、选择性好、灵敏度高、重复性好、检出限低。将该方法应用于大米中汞的检测,获得了满意的结果。     

固定化猪味蕾组织制备苦味生物传感器

用海藻酸钠-淀粉凝胶作固定剂,将猪的味蕾组织固定到两片核微孔膜中间制成“三明治”式味觉传感膜,然后将其固定到玻碳电极上制成味觉生物传感电极,通过电化学工作站测定出蔗糖八乙酸酯、苯甲地那铵和槲皮素刺激其相应受体后的响应电流,结果表明：该传感器对蔗糖八乙酸酯、苯甲地那铵和槲皮素的最低检测限分别为1×10－14、1×10－13 mol/L和1×10－14 mol/L,在浓度分别为1×10－8、1×10－6 mol/L和1×10－9 mol/L时其电流变化率都相应的达到最大值,说明此时它们的受体已经被饱和。蔗糖八乙酸酯在其浓度为1×10－14～1×10－11 mol/L有较好的对数关系（R2=0.957 3）,苯甲地那铵在其浓度为1×10－13～1×10－7 mol/L有很好的对数关系（R2=0.987 3）,而槲皮素在其浓度为1×10－14～1×10－9 mol/L时对数关系比较好（R2=0.996 4）。该传感器不仅可以定量化地测定味觉受体与苦味物质的作用,而且将为以后研究配体受体作用规律提供新的方法。     

利用无标记分子信标及核酸染料TOTO-3检测转基因食品

利用无标记的分子信标,结合核酸染料TOTO-3,采用同步荧光分析法,建立一种高灵敏、高选择性的花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子核酸片段（目标DNA）的定量检测方法。在优化条件下,目标DNA浓度为2×10－10～200×10－10 mol/L之间时,TOTO-3的荧光强度（ΔI）与目标DNA浓度（C）之间具有良好的线性关系,其拟合的回归方程为Δ I = 2.022 2 C＋18.411 1。方法检出限（3σ）为1×10－10 mol/L。该方法重复性好、灵敏度高、选择性好、检出限低。利用该方法,结合不对称聚合酶链式反应技术,实现了对转基因食品的检测。     

茶多酚与大豆分离蛋白的相互作用

利用荧光光谱、紫外-可见光谱和傅里叶变换红外光谱法,研究茶多酚与大豆分离蛋白之间的相互作用。结果表明：茶多酚对大豆分离蛋白有较强的荧光猝灭作用且为静态猝灭,其中,茶多酚与大豆分离蛋白在291、298、310 K时相互作用的表观结合常数分别为4.571×105、2.955×105、2.672×105 L/mol,对应的结合位点数分别为1.316、1.299、1.286。热力学数据分析结果表明：茶多酚与大豆分离蛋白反应的作用力主要是范德华力和氢键作用;同步荧光光谱和紫外-可见光谱表明茶多酚改变了芳香氨基酸残基在空间结构中所处的微环境,使大豆分离蛋白的分子构象发生改变,且同步荧光光谱显示茶多酚与大豆分离蛋白中色氨酸残基发生相互作用,使其周围的疏水作用减少。傅里叶变换红外光谱表明茶多酚引起大豆分离蛋白的二级结构发生改变。     

双酚A在离子液体修饰碳糊电极上的电化学行为及测定

制备1-氰乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体修饰碳糊电极,研究双酚A（bisphenol A,BPA）在离子液体修饰碳糊电极上的电化学行为。结果表明,在0.1 mol/L B-R缓冲液（pH 10.0）中,BPA在0.415 V处产生一良好的氧化峰,具有明显的电催化增敏作用。BPA的氧化过程为伴随有质子转移的表面吸附控制的不可逆过程,其电极反应速率为0.32/s。建立了示差脉冲伏安法测定痕量BPA的方法,线性范围为3.0×10－7～6.0×10－5 mol/L,检出限为5.0×10－8 mol/L（RSN=3）。并将其用于奶瓶样品中迁移BPA的测定,结果表明该传感方法为直接电化学检测BPA提供了一种新的思路。     

紫甘薯花色素与胰蛋白酶相互作用特性

测定紫甘薯花色素与胰蛋白酶反应前后酶的催化活性、催化反应动力学并采用紫外光谱法、荧光光谱法和红外光谱法研究紫甘薯花色素与胰蛋白酶相互作用特性。结果表明：紫甘薯花色素对胰蛋白酶催化活性有明显的抑制作用,抑制类型为可逆的竞争性抑制,抑制常数Ki＝6.16×10－4 mmol/L,当紫甘薯花色素与胰蛋白酶的物质的量比为140∶1,在 37 ℃反应 15 min,抑制率达到38.61%,而反应时间对催化活性的影响不明显;紫甘薯花色素可使胰蛋白酶的内源荧光猝灭,猝灭类型为静态猝灭,室温下猝灭常数Kq为1.73×1012 L/（mol·s）,结合常数KA为3.88×104 L/mol,结合位点数n为0.86;热力学参数确定两者之间的作用力主要为氢键和范德华力;根据Förster能量转移理论得出它们的结合距离为3.56 nm;红外光谱经过去卷积、二阶导数处理得知与紫甘薯花色素作用后胰蛋白酶的α-螺旋含量降低,β-折叠含量升高。     

抑制口腔变异链球菌的乳酸菌筛选及其抑菌机理

利用乳酸菌能抑制有害菌的特性,从实验室保藏的乳酸菌中筛选能抑制口腔变异链球菌的菌株,并测定了筛选菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）,以及其对变异链球菌菌膜形成和黏附性的影响,初步研究其抑菌机理。结果表明,有5 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对变异链球菌具有明显的抑制作用。4 株变异链球菌指示菌中,变异链球菌（Streptococcus mutans）1.2499、1.2500对植物乳杆菌比较敏感。植物乳杆菌K25对变异链球菌的抑制作用比其他4株植物乳杆菌的作用更明显,其MIC最低（1.25×107～2.50×107 CFU/mL）。同时,菌株K25对变异链球菌菌膜形成的抑制率较高,还显著地降低变异链球菌的黏附率。对菌株K25抑菌机理的初步研究表明,其代谢过程中产生的乳酸和过氧化氢起到了主要的抑菌作用。     

脂肽类生物表面活性剂Surfactin的乳化性

采用白金板法对Surfactin的表面活性进行研究,并用浊度法和离心法对其乳化性进行研究。结果表明：Surfactin的临界胶束浓度为9.03×10－5 mol/L,可将水的表面张力由73.98 mN/m降至最低27.48 mN/m。在浓度为1×10－3～1.2×10－2 mol/L的NaCl溶液中,Surfactin溶液的表面张力随盐浓度升高逐渐降低并最终稳定在34 mN/m;Surfactin在121 ℃处理20 min后,其表面张力仍能保持在37.10 mN/m;在pH值为2～12范围内,其表面活性稳定并良好;表明Surfactin具有较强的NaCl浓度、温度、pH值的耐受性。浊度法测得Surfactin亲水亲油平衡（hydrophilelipophilic balance,HLB）值为14,对所需HLB值为12～16的油相乳化性能良好。