副溶血性弧菌vanM基因原核表达及酰基高丝氨酸内酯信号分子鉴定研究

从副溶血性弧菌ATCC33847扩增van M基因,连接到p MD19-T载体进行克隆测序和序列比对;将测序正确的van M序列经Nde I和Eco RI酶切后连接到p ET22b;以IPTG诱导van M基因在BL21(DE3)中表达;利用acyl-HSL报告菌株KYC55检测ATCC33847和带有van M基因的大肠杆菌的acyl-HSL活性;萃取Van M合成的acyl-HSL信号分子,经HPLC-MS测试后与标准品进行对比分析。成功测序了ATCC33847 van M基因,与鳗弧菌van M基因序列相似性达到57%;并构建了p ET22b-van M表达质粒,以0.6 mmol/L IPTG诱导BL21(DE3)表达系统时Van M融合蛋白表达量最大;经过KYC55检测ATCC33847和带有p ET22b-van M的大肠杆菌能够产生acyl-HSL活性;HPLC-MS分析显示,ATCC33847和携带p ET22b-van M的BL21(DE3)萃取物中含有3-Hydroxybutanoyl-HSL(3-OH-C4-HSL)和3-Hydroxydecanoyl-HSL(3-OH-C10-HSL)信号分子。本研究克隆表达了副溶血性弧菌van M,首次证明了副溶血性弧菌利用Van M信号分子合成酶合成acyl-HSL信号分子3-OH-C4-HSL和3-OH-C10-HSL。     

酸奶中污染酵母菌和霉菌的分离及鉴定

以室温放置直至变质的市售酸奶为样品,从中分离出2株酵母菌和4株霉菌,分别命名为Y1、Y2、M1、M2、M3、M4。酵母菌采用形态学和26SrDNAD1/D2区序列分析鉴定,确定Y1为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis),Y2为马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。霉菌经菌落及菌体形态学鉴定,确定M1、M2、M4为青霉(Penicillum),M3为白地霉(Geotrichum candidum)。     

EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达

目的　在大肠杆菌中表达可溶性EC -SOD。方法　将表达质粒EC -pet2 8a(+)转入宿主菌BL2 1 (DE3)plysS中进行表达,在低温下培养含表达质粒EC -pet2 8a(+)的宿主菌BL2 1 (DE3) ,通过SDS -PAGE电泳,观察其在超声上清中的表达。结果　EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中表达,其量比在BL2 1 (DE3)降低约2 0 %,上清中有明显表达;在2 0℃和1 5℃培养时,EC -SOD在BL2 1 (DE3)的超声上清中有表达。结论　EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中或在BL2 1 (DE3)中低温培养,均可实现部分上清中的表达。     

β-1,3- 葡聚糖酶基因克隆、表达及抗菌活性的研究

通过RT-PCR的方法分别从小麦和水稻的cDNA中克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu基因),分别命名为TaGlu9507和OsGlu30。它们的序列分析表明这两个克隆均含一个1002bp的开放阅读框(ORF),编码334个氨基酸,各自的N-端含有一个长20和29个氨基酸残基的信号肽序列。将不含信号肽序列的TaGlu9507和OsGlu30编码区DNA片段分别克隆进pET28-a(+)表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3),经0.5mmol/L IPTG诱导3h后获得了高量表达,表达量分别占大肠杆菌可溶性蛋白的49.7%和26.7%,表达产物对黑曲霉、酵母等真菌生长均有较为明显的抑制作用。本结果更进一步表明β-1,3-葡聚糖酶基因是植物真菌病防治的潜在目的基因群之一。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

TBa过敏原表位区段的融合表达及免疫活性分析

为了确定苦荞过敏原TBa(tartarybuckwheatallergen)的抗原表位及进一步了解荞麦过敏反应机制,本实验以苦荞过敏原TBacDNA序列为模板,设计引物,克隆苦荞过敏原TBa表位区段基因,分别构建TBa及两个表位区段原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并纯化,采用竞争ELISA对其免疫活性进行分析与比较。SDS-PAGE及WesternBlot鉴定和检测结果表明,目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中可高效表达,其N端带有6个组氨酸标签。Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化得到了纯度较高的目的片段。ELISA实验结果显示,表达产物与荞麦食品过敏病人血清中的IgE具有特异的结合活性。本研究为揭示苦荞过敏蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

仿生鲶鱼抗菌肽编码序列的设计及克隆

人工合成的仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列，经聚合酶链式反应(PCR)扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3．将此基因克隆至载体pGEX-5X-3，成功构建了三串联的重组质粒．测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃IPTG诱导，获得高效表达，SDS—PAGE扫描分析表明，融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30％，融合蛋白以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中．     

海藻德合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD_(600))至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高.     

特氏杜氏藻中乙酰辅酶A合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定

乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化合成乙酰辅酶A,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)乙酰辅酶A合成酶(Dt ACS)的c DNA全长(2464 bp),预测其开放阅读框(ORF)为2184 bp,727个氨基酸由此段编码。序列比对显示Dt ACS与绿藻ACS最为相似(与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri f.nagariensis有70%一致)。选用带有硫氧还蛋白标签(Trx-tag)的pET32a(+)作为原核表达载体,并将Dt ACS转入pET32a(+)中从而构建了pET-32a-Dt ACS质粒。将其转入BL21(DE3)感受态细胞中,同时将pET-32a空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中,分别得到重组菌pET-32a-Dt ACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a-BL21(DE3)。将重组菌在18℃、终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下诱导12 h,表达出来的带有Trx-His标签融合蛋白的Dt ACS约为8.74 ku(6.99ku+1.75 ku)。此外,将表达得到的重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化,纯化后蛋白比活力为52.87 U/mg。     

牛凝乳酶基因的克隆与表达

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)-内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒:pTWIN1/EchybF2.经转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下进行凝乳酶的表达.SDS-PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示,CBD-intein-EchybF2融合蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在,并具有凝乳活性.     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

具纤溶活性菌株ND2的筛选及其纳豆激酶基因的克隆、表达

从市售的纳豆制品中分离并纯化出一株具有高效纤溶活性的菌株ND2,经生理生化特性及16SrRNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。通过正交试验优化菌株ND2的发酵条件,得到ND2产纳豆激酶的最佳条件:氮源-大豆蛋白胨,碳源-淀粉,碳氮比3:1,37℃,pH6.0。经PCR扩增得到825bp的纳豆激酶成熟肽基因,采用pET32a(+)表达载体和BL21(DE3)为宿主菌,在温度为37℃、1‰IPTG浓度下可诱导获得较高表达量的重组纳豆激酶。     

西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析

利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列(Gly4Ser)3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段(scFv),亚克隆至原核表达载体pET30a(+),并转化感受态细胞B121(DE3)进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为2001xg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性.结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性.     

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

乙酸异戊酯高产菌株脂肪酶基因Lip2的克隆及表达研究

通过PCR扩增了乙酸异戊酯高产菌Loq-c的脂肪酶基因Lip2,其序列与Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列号X64704.1)的序列相似度最高,为89%。构建原核表达载体p QE-lip2,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),获得了重组菌BL21(p QE-lip2)。经过表达条件探索,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,脂肪酶Lip2原核可溶表达最佳条件为:诱导温度30℃,IPTG使用浓度为1.5 mmol/L,150 r/min转速的条件下诱导表达5 h。     

羰基还原酶工程菌构建及其应用于还原制备S-CHBE

S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)是多种药物的手性中间体,可由4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原合成。该研究对来自Candida magnoliae AKU4643的S1羰基还原酶基因进行E.coli密码子优化,获得的S1'基因序列并进行人工合成,利用该序列构建了基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-S1',提高了羰基还原酶表达效率,经诱导条件优化后羰基还原酶活力达11.49 U/mg蛋白;将BL21(DE3)/pET28a-S1'与E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh进行偶联,在单一水相中未添加辅酶条件下转化10 h,产物的摩尔转化率和对映体过量值(e.e.)分别达92.1%和100%。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.