细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。     

转基因番茄表达口服乙肝疫苗

将构建好的植物表达载体pCAMBIA1301/HB转化到根癌农杆菌LBA4404中,并通过农杆菌介导转化番茄。所得再生植株经PCR和Southern杂交鉴定确认成功整合了HBsAg(hepatitis B surface antigen)基因,SDS-PAGE显示蛋白表达与非转化植株相比有明显差异,ELISA检测和Western blotting证实HBsAg已在转化植株中表达,分子量约为24kD。     

根癌农杆菌介导载体pBI121转化少根根霉条件的研究

考察了脂肪酶生产菌株少根根霉N1023 G418的敏感性,结果表明,G418对少根根霉最小抑制浓度为500μg/mL。研究了不同条件对载体pBI121转化少根根霉的影响,结果表明,以根癌农杆菌LBA4404为介导菌,少根根霉N1023为受体菌株,G418为筛选标记的最佳转化条件为:乙酰丁香酮(AS)300μmol/L、根癌农杆菌的初始浓度OD600为0.6、共培养时间2 d。在此条件下pBI121对少根根霉的转化率达到112 cfu/106 cfu孢子。转化菌株经过5次连续培养后仍然稳定。通过上述研究,建立了根癌农杆菌介导载体pBI121转化少根根霉的方法。这是首次成功建立少根根霉的转化方法,为进一步的研究奠定了基础。     

影响根癌农杆菌的电击转化条件

采用电击转化方法将双元载体质粒pCAM3300导入根癌农杆菌LBA4404,研究了不同实验条件对转化率的影响.结果表明:当电场强度为11 kV/cm时,转化率最高,每微克DNA得到9.8×103CFU;在细胞OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,每微克DNA得到9.54×103CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细菌浓度密切相关,转化率随着细菌浓度的上升而上升;质粒大小与电击转化率之间没有明确的关系.将含pCAMBIA3300的根癌农杆菌与粗糙脉胞菌共培养转化,在含有膦化麦黄桐(PPT)(405 mg/L)的平板上筛选到转化子.PCR扩增转化子的染色体,初步证明Bar基因整合进粗糙脉胞菌的染色体中.     

两种抗生素对甜菜离体叶柄分化的影响

在培养基中添加不同浓度的卡那霉素和壮观霉素，观察抗生素对甜菜叶柄分化再生的影响。结果表明：一定浓度的卡那霉素和壮观霉素对甜菜叶柄的分化均具有抑制作用，当卡那霉素浓度为50mg/L时，叶柄分化率明显变化，当浓度达到100mg/L时，分化率为1．4％。当壮观霉素浓度为40mg/L和50mg／L时，分化率为5．7％和3．7％，当浓度为60mg/L时，基本无绿芽分化，统计学分析显示：壮观霉素的抑制作用要强于卡那霉素。结合实验结果讨论了这两种抗生素作为甜菜遗传转化研究的筛选标记的适宜浓度。     

烟草侧芽生长相关基因克隆及RNAi载体的构建转化

为了培育打顶后不长侧芽的烟草植株,通过同源克隆,在烟草(品种K326)中得到了与侧芽生长相关基因的1个片断,将该片段序列通过BLAST检索Genbank同源比对,发现该基因同番茄的LS基因有非常高的同源序列,另外与水稻的MOC基因、拟南芥的LAS基因也有一定的同源性,命名为TLR基因.将TLR基因阅读框内640 bp的正向和反向片断构建到RNAi载体pHANNIBAL内含子两侧,再经NotI酶切回收约4300 bp目的片段,并插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含TLR基因片段正反向重复序列的植物表达载体pHANNIB AL-TLR-P ART27.将pHANNIB AL-TLR-P ART27质粒导入根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,没有得到转基因再生植株,推测这与TLR基因表达被抑制有关.     

甘蔗农业文摘(四)

农杜菌介导的甘蔗遗传转化研究──标如凯等，甘蔗，1996，3（3），1～4选用在组织培养过程中能够产生分泌较多酚类物质的甘蔗基因型福农86／17为材料，以幼叶切段为外值体，采用叶盘法与土壤根癌农杆菌菌珠LBA4404（pLL4404pTD1）菌液共培养。外格体设预培养1天、3天、5天、7天和10天五种时间，农杆菌设稀释10倍和20倍两种浓度，共10种处理组合，共培养48，小时。结果预培养5天，农杆菌稀释10倍和20信两处理组合的外植体，在合卡那霉素300mg／L的选择诱导和选择继代培养基中诱导并形成抗怀愈伤组织。甘蔗农业文摘(四)…     

农杆菌介导快速、高效获得转基因烟草纯合株系

利用植物表达载体PBI121空载体,对农杆菌介导法转化烟草技术体系进行了综合改进,探索激素配比、侵染时间、分化和生根培养阶段卡那霉素的筛选压对烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)植株再生和转化效率的影响;同时根据孟德尔显性性状杂合子自交后代遗传分离规律,在转基因株系后代扩繁时用卡那霉素筛选分离,可以在T2代较快得到纯合株系.本研究通过使用整个叶片浸染、高的卡那霉素筛选剂浓度、控制生长条件以及强化管理,极大地缩短了获得纯合株系的时间,确立了该烟草品种快速、高效获得大量转基因阳性植株及快速获得转基因纯合株系的转化体系,其转化周期可减少至5-6个月,转基因植株阳性率可达到90％,其中60％的转基因植株后代卡那霉素抗性性状分离比例接近3:1.     

根癌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白融合基因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200μmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。     

甜菜遗传转化及PCR检测

用农杆菌介导方法,将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白（BNYVV CP）基因和丛根病外壳蛋白（BBSV CP）基因转化甜菜不同品系茎节外植体。以卡那霉素作为筛选标记基因,获得抗卡那霉素再生植株。再生植株经PCR扩增,获得目的基因大小的DNA片段,初步证明为转基因植株。     

转OjDREB基因提高烟草耐盐能力的研究

利用农杆菌介导法将沿阶草OjDREB基因转入烟草植株中.通过RT-PCR检测,获得转OjDREB基因的烟草植株.以400 mmol/L NaC1处理转基因烟草植株和野生型对照10 d后,结果显示:转基因烟草体内叶绿素含量和SOD酶活性是野生型对照的16.98倍和1.91倍;体内的MDA含量和电解质渗透率分别是野生型对照的59.23％和55.07％,说明过量表达OjDREB基因可以提高烟草的耐盐能力.     

Expression of Human Hepatitis B Virus Surface Antigen Middle Protein Gene in Transgenic Tobacco: Potential for Edible Vaccines

Hepatitis B virus is responsible for significant morbidity and mortality despite the availability of safe and effective injectable vaccines. Transgenic plants are a novel system for expression and oral delivery of subunit vaccine antigens. In this paper, plant expression vector pBIS2S, which contains the HBsAg gene with precursor sequence preS2, was reconstructed based on pBI121 and was introduced into tobacco by the co-cultivating leaf-section method via Agrobacterium tumefaciens LBA4404. After selection by kanamycin and confirmation by PCR and Southern blot, it was found that the objective fragment had integrated into the tobacco genome. ELISA analysis showed that the hepatitis B surface antigen (HbsAg) was expressed in transgenic tobacco plants. These results indicate that the production of HbsAg with PreS2 extended to food plants as a source of edible vaccines is possible.     

农杆菌介导小球藻快速转化方法的建立与条件优化

基于根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的方法实现异养蛋白核小球藻快速遗传转化,并优化转化条件。结果表明,小球藻异养生长条件的碳氮组合配比为葡萄糖20 g/L和酵母粉2 g/L时,生长速率为自养的3～5倍;根瘤农杆菌GV3101和LBA4404均可成功实现对异养小球藻的遗传转化,且转化效率无显著性差异（P＞0.05）。最优转化条件为根瘤农杆菌GV3101初始OD600 nm值= 0.8,小球藻（Chlorella pyrenoidosa）浓度为107个/mL,各取100 μL混合涂布在pH=5.4、乙酰丁香酮浓度为200 μmol/L的CM平板上,24 ℃避光培养40 h后转到筛选平板,仅2 d转化子便清晰可见,数目达88个/106微藻。转化过程整体耗时仅5 d,普遍比自养微藻转化时间缩短3倍以上,为小球藻代谢工程改造提供技术手段,同时为其他可异养培养微藻的短时高效遗传转化提供科学依据。     

Development of simple and efficient in planta transformation method for rice (Oryza sativa L.) using Agrobacterium tumefaciens

Seeds of rice (Oryza sativa L. var. Koshihikari) were soaked in water for 2 d. Thereafter, the embryo containing an apical meristem was inoculated with Agrobacterium tumefaciens by piercing a site of the husk overlying the embryonic apical meristem with a needle that had been dipped in an A. tumefaciens inoculum. The inoculated seeds were then grown to maturation (T0 plants) and allowed to pollinate naturally to set seeds (T1 plants) in pots under nonsterile conditions. To examine the transformation by various means, three different strains of A. tumefaciens were used for transformation: an M-21 mutant, which is an avirulent mutant with a Tn5 insertion in the iaaM gene, and two LBA4404 strains each with a different binary vector. Five different lines of evidence were demonstrated the transformation: the altered phenotype and its inheritance by the next generation, histochemical detection of beta-glucuronidase, resistance to hygromycin B, detection of the transgene by PCR and rescue of a plasmid consisting of the integrated T-DNA and the flanking rice genome DNA. Transformation efficiency of T1 plants was estimated to be 40% and 43% by PCR and a histochemical assay of beta-glucuronidase, respectively.     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

Expression of Human Hepatitis B Virus Surface Antigen Middle Protein Gene in Transgenic Tobacco: Potential for Edible Vaccines

Hepatitis B virus is responsible for significant morbidity and mortality despite the availability of safe and effective injectable vaccines. Transgenic plants are a novel system for expression and oral delivery of subunit vaccine antigens. In this paper, plant expression vector pBIS2S, which contains the HBsAg gene with precursor sequence preS2, was reconstructed based on pBI121 and was introduced into tobacco by the co-cultivating leaf-section method via Agrobacterium tumefaciens LBA4404. After selection by kanamycin and confirmation by PCR and Southern blot, it was found that the objective fragment had integrated into the tobacco genome. ELISA analysis showed that the hepatitis B surface antigen (HbsAg) was expressed in transgenic tobacco plants. These results indicate that the production of HbsAg with PreS2 extended to food plants as a source of edible vaccines is possible.     

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定,再用Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式PCR(Semi-nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因;利用限制性内切酶Hind Ⅲ对半嵌套式PCR产物进行酶切,从而验证半嵌套式PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明,半嵌套式PCR是一种快速、灵敏的检测转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的方法。