海藻糖合成酶活性测定方法的研究

目的 研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法.方法 用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖,用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖,DNS法测定还原糖,差值法计算海藻糖合成酶活性.结果 获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法,成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性.结论 此方法设备简单,易于同时测定较多的样品,适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定.     

海藻糖合成酶活性测定方法的研究

目的 研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法.方法 用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖,用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖,DNS法测定还原糖,差值法计算海藻糖合成酶活性.结果 获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法,成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性.结论 此方法设备简单,易于同时测定较多的样品,适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定.     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

极地微生物产海藻糖合成酶菌株的筛选

来源于极地的微生物经过筛选,得到能产海藻糖合成酶的耐冷菌株S1和S2,分别用TLC、DNS和HPLC的方法确证其酶反应的产物为海藻糖.以质量分数1%麦芽糖为底物,S1粗酶液能将麦芽糖转化为海藻糖,并且没有明显的葡萄糖生成,在pH值7.0的磷酸盐缓冲液下15℃反应48h,经过HPLC测定转化率最高达到75.2%.     

密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平

目的优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平。方法基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1。基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平。结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8%降低至54.4%,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3%以上。结论密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考。     

聚丙烯腈膜固定化海藻糖合成酶的研究

以聚丙烯腈膜(PAN)为载体,采用吸附法固定化海藻糖合成酶粗酶液。通过单因素法探讨最佳固定化条件,并分析固定化酶酶学性质。结果表明,最佳固定化条件为:pH 7.6、30℃、加酶量0.1 mg/cm~2条件下震荡吸附3 h;该条件下制备的固定化酶最适反应条件为:温度40℃、pH 7.4、初始麦芽糖底物浓度200 g/L。与游离酶相比,固定化酶热稳定性提高10℃、酸碱稳定性由pH 6.6～7.4扩展至pH 5.4～8.0;反应达到平衡时,反应液中海藻糖含量为50.9%,副产物葡萄糖含量为9.1%,较游离酶降低6个百分点,在目前已报道的固定化海藻糖合成酶催化反应中副产物含量最低;在40℃、pH 7.4、麦芽糖底物浓度200 g/L条件下,重复使用累计72 h后,固定化酶活仍保留在初始酶活的64.4%。     

海藻糖生产方法及其合成酶研究进展

综述国内外有关海藻糖生产方法,总结和比较不同来源海藻糖合成酶的酶学性质及其基因工程方面的最新研究结果,提出海藻糖合成酶结构的解析及分子改造是今后海藻糖合成酶基因工程研究的主要方向.     

ARTP诱变选育高产海藻糖菌株及酶促反应条件优化

以实验室保藏的节杆菌属菌株Arthrobacter sp.SH为出发菌株,经常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变选育后,筛选到一株以淀粉为原料Tre Y-Tre Z途径生产海藻糖的高产突变菌株Arthrobacter sp.SH-52。该突变菌株酶催化能力达到129.6 U/m L,比出发菌株提高了46.1%。对菌株Arthrobacter sp.SH-52的酶促反应条件进行优化,结果表明,酶促反应最适温度45℃,最适反应时间30 h,最适初始p H 6.5,最适底物为浓度20%的淀粉液化液(DE值为11.9)。经酶促反应优化后,采用未经纯化的粗酶液进行催化,转化率达到37.6%。实验结果表明ARTP诱变是选育高酶活海藻糖生产菌的有效方法,研究结果对工业化生产海藻糖具有一定的借鉴价值。     

透性化细胞海藻糖合酶特性的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂，目前多以微生物酶法生产。海藻糖合酶是近年来新发现的一种海藻糖合成酶。本文研究了经渗透细胞技术处理得到的透性化细胞海藻糖合酶的酶学特性。结果表明，该细胞酶的反应最适温度为35℃，最适pH7.4,Mg^2 及K^ 对该细胞酶有明显激活作用，Zn^2 ,Mn^2 及Cu^2 则可强烈地抑制酶活力。该酶对底物特异性极强，能特异性地将麦芽糖转化为海藻糖。     

采用可视化方法通透性处理大肠杆菌细胞生产海藻糖合成酶

采用一种新的工业过程操作优化方法——可视化优化方法,对利用生物表面活性剂硫酸粘杆菌素通透性处理重组大肠杆菌BL21生产海藻糖合成酶的工艺条件进行优化。结果表明:以1.40 g/L的硫酸粘杆菌素为渗透剂,35℃渗透处理72 min,即得透性化细胞海藻糖合酶,酶活是传统超声破碎法制得的2.09倍。所得透性化细胞间歇反应时,以30%麦芽糖为底物进行海藻糖转化实验,转化率可达70%,重复使用16批(12 h/批),转化率可保持在65%以上。     

A STUDY OF VIABILITY AND TREHALOSE METABOLISM IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE VACUOLAR DEFICIENT MUTANT SKD2

The vacuolar deficient mutant SKD2 and a closely related vacuole complete strain SKD1ρ^? were studied to identify the cause of low trehalose accumulation in SKD2. The present work indicates that low intracellular trehalose levels in SKD2 result from reduced activity of enzymes of the trehalose-6-phosphate synthase/phosphatase complex rather than higher activity of trehalase in the cytosol caused by supposed ineffective compartmentalisation of vacuolar acid trehalase. In vitro studies using crude enzyme extracts from SKD2 and SKD1ρ^? also suggested that loss of viability of SKD2 might result from a fall in free phosphate levels as sugar phosphates accumulated .     

海藻糖合成酶产生菌筛选、鉴定及其产酶特性

以麦芽糖为唯一碳源高盐培养基,经高温培养,从温泉水样及其附近土壤中筛选得到一株菌株T2,经过生物合成途径初步验证,该菌株产海藻糖合酶,能够通过海藻糖合成酶（TreS）途径将麦芽糖转化为海藻糖。菌株T2为革兰氏阳性菌,杆状,有芽孢,经过生物学鉴定,将其初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。对其产海藻糖合酶的酶学性质进行了研究：酶反应最适作用温度为60 ℃,在60 ℃条件下保温100 min仍能保持酶活性80.7%;最适作用pH值为7.0,在pH 6.0～7.5范围内稳定。采用正交试验对其发酵培养基配方进行了优化研究,确定了最佳的培养基组成为牛肉膏3.0 g/L,麦芽糖20.0 g/L,蛋白胨7.5 g/L,无机盐（K2HPO4＋NaH2PO4＋MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此条件下,菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到310.6 U/L。     

一株海藻糖产生菌T007酶学特性的研究

对自行从土壤中筛选分离出的一株能合成海糖藻的菌株T007的酶学特性进行了研究。该酶最适反应温度为38～40℃，最适反应pH为pH6．6～7．2，Mg^2＋、K^＋对该酶有一定的激活作用，Ca^2＋、Ba^2＋、Mn^2＋对该酶有抑制作用，而Zn^2＋、Cu^2＋、Hg^2＋则可强烈地抑制该酶活力。试验证实，该菌株是在海藻糖合酶（trehalose svnthase）作用下特异性地以麦芽糖为底物转化为海藻糖的。该细胞酶在4℃保存14d酶活力仍保持稳定，-18℃保存期可延长到30d。     

一株芽孢表面稳定展示海藻糖合酶工程菌的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因组为模板,PCR扩增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,重叠PCR连接sleB1与卡那霉素抗性(kmr )基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleB菌株;连接cwlJ1与博来霉素抗性(zeor)基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。结果表明,经kmr、zeor抗性筛选及PCR鉴定,成功获得sleB、cwlJ基因双缺失菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ;发酵结果显示,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ与出发菌株的芽孢形成率一致,约为88%;在LB固体培养基和麦芽糖转化生成海藻糖体系中B. subtilis 168-Tres的芽孢萌发数为4.8×108 CFU/mL,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,重组菌海藻糖合酶酶活为10.42 U,比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后,不影响枯草芽孢杆菌生成芽孢的量,但能有效控制芽孢在上述转化体系中的萌发,使芽孢表面稳定展示海藻糖合酶,提高了芽孢的利用率。     

产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化

从土壤中分离筛选得到一株能合成海藻糖的菌株,经生物转化途径验证,该菌株含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的海藻糖合酶,以海藻糖转化率为评价指标,对其进行摇瓶发酵条件的优化。结果表明,其发酵最适条件为：碳源为2%麦芽糖,氮源为0.5%酵母粉和1%蛋白胨,发酵初始pH值为7.0,接种量4%,发酵温度35 ℃,发酵时间48 h,在此优化条件下,海藻糖的转化率为50%。     

重组海藻糖合酶工程菌高密度发酵条件的研究

目的:通过对前期构建的海藻糖合酶基因工程菌进行高密度发酵的研究,获得了其高密度工艺条件。方法:采用摇瓶发酵和10L自控罐高密度发酵研究了培养基、pH、发酵方式对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并考察了工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果:海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的培养基为2YT+0.2%葡萄糖,最适pH为7.0,发酵方式为分批补料,通过10L自控罐高密度发酵最终得到的工程菌细胞密度达到了50.78g/L,酶活达到了3.197U/mL。所构建的重组质粒在宿主中得到了稳定遗传。结论:优化了海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的条件,为海藻糖规模化生产奠定了基础。     

透性化海藻糖合酶的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂 ,目前其主要生产方法是利用微生物酶法合成。文章研究了在不易破壁取得胞内酶的情况下 ,采用渗透处理细胞技术生产透性化细胞酶的方法 ,获得较高酶活力     

冷冻保护剂对直投式木葡萄酸醋杆菌发酵剂菌体细胞特性的影响

本文研究了1%谷氨酸、5%海藻糖、10%脱脂乳及复合0.575%谷氨酸+0.075%海藻糖+6.4%脱脂乳作为冷冻保护剂对直投式木葡萄酸醋杆菌(GBX)发酵剂菌体细胞特性的影响,通过测定GBX发酵剂菌体细胞的DNA泄露、细胞液总抗氧化能力、SOD活性、纤维素合成酶活性和ATP酶活性变化等情况来衡量GBX菌体细胞的生理活性变化。结果发现:添加单一1%谷氨酸、5%海藻糖、10%脱脂乳以及复合0.575%谷氨酸+0.075%海藻糖+6.4%脱脂乳作为保护剂均能明显抑制冷冻干燥过程中菌体细胞的DNA泄露,提高细胞总抗氧化能力、SOD活性、纤维素合成酶和ATP酶活性,表明添加冷冻保护剂能够一定程度上保护菌体细胞,其中复合保护剂对菌体细胞的保护效果最佳,电子扫描显微镜也验证了冷冻保护剂能确实降低菌体细胞在冷冻干燥过程中损害程度,从而使菌体细胞保持良好的生理活性。     

Enhanced production of trehalose in Escherichia coli by homologous expression of otsBA in the presence of the trehalase inhibitor, validamycin A, at high osmolarity

Trehalose production in Escherichia coli DH5α was explored by overexpressing otsBA operon encoding trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase. Production and subsequent degradation of trehalose resulted in low production of trehalose in engineered cells overexpressing otsBA, which was primarily due to the concomitant expression of endogenous trehalase. Through an in vitro enzyme assay and flask cultures of engineered cells, trehalase expression was shown to be directly related to the expression of otsBA rather than osmotic stress. Validamycin A effectively inhibited E. coli trehalase and the intracellular accumulation of trehalose was markedly enhanced in the presence of validamycin A at an optimal concentration in the medium. The trehalose production was further increased upon growth in a hypertonic medium in the presence of validamycin A, with most trehalose accumulating as an intracellular product. The highest titer was obtained when otsBA expression was induced by a medium-copy vector, ptrc99A, with 0.5mM of isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside. Trehalose titer was 1.7 g/L in controlled bioreactor cultures using synthetic M9 medium supplemented with 40 g/L glycerol, 0.1mM validamycin A, and 300 mM NaCl.     

Production of trehalose by intramolecular transglucosylation of maltose catalysed by a new enzyme from Thermus thermophilus HB-8

Thermus thermophilus HB-8 is a source of trehalose synthase (GTase), which catalyses conversion of maltose into trehalose. Specific activity of maltose transglucosylation by cell-free extracts of the bacteria was about 0.1 U mg⁻¹ protein and precipitation at 28% saturation of ammonium sulphate caused 3.5-fold enzyme purification. The optimum temperature for conversion of maltose into trehalose was 65 °C with about 27% of maximum activity at 85 °C. The highest GTase productivity was achieved at cultivation temperature over 60 °C and at NaCl concentration range of 0.1–0.5% (w/v). However, larger concentrations of sodium chloride in the growth media caused a remarkable decrease of GTase synthesis. The results, of ammonium sulphate fractionation and activity towards maltotriose (0.028 U mg⁻¹), maltotetraose (0.16 U mg⁻¹) and GlcαpNp (0.27 U mg⁻¹), show that trehalose synthase and α-glucosidase activities reside in separate protein fractions of cell-free extracts from T. thermophilus cells.