基于Illumina MiSeq高通量测序技术解析利川酱豆真菌多样性

该研究利用Illumina MiSeq高通量测序技术对湖北省恩施土家族苗族自治州利川市酱豆样品的真菌多样性和群落结构进行解析。结果表明,利川酱豆样品中的真菌菌群隶属于3个门、15个纲、27个目、34个科、45个属,核心真菌门为子囊菌门（Ascomycota）（96.79%）和担子菌门（Basidiomycota）（2.63%）;核心真菌属为毕赤酵母属（Pichia）（37.46%）、曲霉属（Aspergillus）（29.48%）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）（3.92%）、假丝酵母属（Candida）（2.86%）、Starmerella（2.62%）、节担菌属（Wallemia）（2.19%）和镰刀菌属（Fusarium）（1.03%）,且核心真菌之间的相关性均不显著（P＞0.05）。     

规模化发酵泡菜生产中的真菌多样性

四川泡菜是四川省四大腌菜之一,为了解其真菌多样性,采用构建18SrRNA文库及ARDRA分型分析,对萝卜、豇豆、青菜和榨菜四种不同原料泡菜样品进行研究。结果表明:所得到的724个阳性克隆子分布于9个类群,萝卜、豇豆、青菜和榨菜的主要优势菌分别为:Debaryomyces;Debaryomyces和Starmerella;Debaryomyces;Starmerella,Debaryomyces和Candida。检测到的次生优势菌有Zygosaccharomyces,Pichia,Halophytophthora等。此研究结果揭示四川泡菜中的微生物多样性,反映不同原料泡菜的微生物群落结构及其差异性,可为揭示泡菜发酵机理、风味因子的形成机制以及工业化生产提供一定的理论基础。     

盐渍白萝卜的真菌菌群结构DGGE分析及酵母菌分离鉴定

采用变性梯度凝胶电泳技术(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)对不同盐渍白萝卜样品的真菌菌群结构分析表明,Candida lactis-condensi、Candida versatilis、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、汉逊德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)为盐渍萝卜的优势菌。通过传统分离培养技术从样品中分离到17株酵母菌,通过分子生物学鉴定为Pichia sp.、膜醭毕赤酵母(Pichia membranefaciens)、德巴利酵母属(Debaryomyces sp.)。传统分离培养技术未分离到Candida lactis-condensi,Candida versatilis。DGGE技术能够快速高效、直观地反映盐渍白萝卜的菌群结构,结果合理。     

陕西茯砖茶的微生物多样性和群落结构

陕西是茯砖茶的起源地和主产区之一,为分析陕西茯砖茶微生物组成,采用Illumina MiSeq对6个样品中细菌16S rRNA基因和真菌ITS1基因测序并做序列分析。结果显示,只有sx4和sx5两个样品检出细菌,优势属包括Enterococcus、Lactobacillus、Akkermansia、Parabacteroides、Faecalibacterium。真菌的优势属为Aspergillus,平均相对丰度为99.123%,最优势的种可能为Aspergillus amstelodami、Aspergillus chevalieri、Eurotiumsp.、Aspergillus spiculosus、Aspergillus heterocaryoticus、Aspergillussp.、Aspergillus ruber、Aspergillus cristatus中的一种或几种,还包括曲霉Aspergillus cibarius(4.138%)、Aspergillus piperis(0.879%)、Aspergillus penicillioides(0.019%)、Aspergillus gracilis(0.0058%);酶母Candida、Cyberlindnera、Cryptococcus、Guehomyces;霉菌Mortierella、Humicola、Fusarium、Gibberella、Phoma。该研究阐述了陕西茯砖茶样品中细菌和真菌的多样性和群落结构,可为地理标志产品保护提供参考。     

泡菜发酵过程中真菌群落结构研究及优势真菌菌群变化分析

采用构建18SrDNA克隆文库及ARDRA分型分析对发酵过程中青菜泡菜样品进行研究,了解其真菌的多样性。结果表明:所得到的744个阳性克隆子分布于11个类群,其绝对优势真菌Debaryomyces贯彻整个发酵中期,Pichia在发酵第15天为绝对优势菌,Kodamaea ohmeri在发酵第81天为绝对优势菌,检测到的主要优势真菌有Candida等。荧光定量qPCR的结果与克隆文库基本吻合,进一步说明了克隆文库的准确性。此结果不仅能够较全面、真实地反映同种原料泡菜发酵过程中真菌的群落结构及差异,而且能发挥免培养技术的优势,可为泡菜等发酵食品的研究应用提供一定的理论基础。     

基于Illumina MiSeq高通量测序技术内蒙古巴彦淖尔市 酸粥真菌菌群多样性分析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术解析内蒙古巴彦淖尔地区酸粥样品中的真菌菌群多样性。结果表明，酸粥样品中的优势真菌门（平均相对丰度＞1.0%）为子囊菌门（Ascomycota）（98.11%）；优势真菌属为毕赤酵母属（Pichia）（37.32%）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）（20.34%）、酵母属（Saccharomyces）（11.03%）、耐碱酵母属（Galactomyces）（9.41%）、假丝酵母属（Candida）（5.88%）、曲霉属（Aspergillus）（4.44%）、伊萨酵母属（Issatchenkia）（2.69%）和德巴利酵母属（Debaryomyces）（1.51%）。8份样品共包含50个核心操作分类单元（OTU）（存在于所有样品中的OTU），其中有15个为优势OTU，分别被注释到8个优势菌属中，累计相对含量达92.49%，具有显著相关性的核心优势OTU间均为正相关关系，该酸粥样品中的真菌类群以Pichia等酵母菌为主，且核心真菌菌群之间大多为正相关关系。     

贵州不同地区“生花”糟辣椒中微生物多样性研究

采用Miseq高通量测序技术、传统培养分离法对贵州不同地区的“生花”糟辣椒中微生物进行多样性分析和菌种分离，获得引起糟辣椒“生花”现象的主要微生物。结果表明，4个样品微生物菌相丰度和多样性及传统分离的菌种差异较大，获得细菌和真菌的有效序列分别为97 306条、288 570条。在门水平上，共检测出4个主要细菌门和1个真菌门；在属水平上，共检测出13个主要细菌属及3个主要真菌属。通过基于16S rDNA、ITS测序鉴定并结合菌株发酵特性试验和回接验证试验，获得可引起糟辣椒出现“生花”现象的4株酵母菌分别为库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevi）、膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。该研究结果为糟辣椒的保质技术奠定了基础。     

二轮盐渍工业泡菜微生物群落结构解析

泡菜,是一种利用本土微生物自然发酵的传统蔬菜制品,其中二轮盐渍工艺是目前工业化泡菜常用的发酵方式。为了解二轮盐渍工业泡菜贮存中微生物群落结构,采用传统可培养方法,结合16S rDNA和26S rDNA测序技术,对自然发酵1年以上的豇豆、萝卜、青菜和榨菜4种泡菜的细菌和真菌群落结构进行研究。结果表明:二轮盐渍工业泡菜pH低、酸度和盐度高,微生物数量都小于10~5cfu/mL,发酵程度弱。豇豆、萝卜、青菜和榨菜的主要优势细菌为芽孢杆菌属,种水平上分析分别为Bacillus altitudinis和Bacillus subtilis;Bacillus muralis,B.altitudinis和Bacillus megaterium;B.altitudinis,B.megaterium和Bacillus methylotrophicus;Lactobacillus alimentarius,B.altitudinis和B.megaterium。优势真菌分别为Candidaapicola;Debaryomyces hansenii和Zygosaccharomyces bisporus;Candida etchellsii和Pichia membranifaciens;Candida lactiscondensi和D.hansenii。此结果揭示了二轮盐渍工业泡菜长时间储存后微生物群落结构,对解释泡菜长时间存放品质下降、泡菜香味增加具有参考依据,也为企业调控生产和筛选特性菌种提供了参考价值。     

传统四川泡菜发酵过程中酵母菌分离鉴定

以红皮萝卜为原料,分别用自然发酵法、老泡菜水发酵法泡制四川泡菜,采用传统的分离培养方法、26S r DNA序列测定技术,研究不同发酵时期各泡菜水中的酵母菌群分布及动态变化。研究结果表明,发酵过程中共存在5种酵母菌,经鉴定其依次为清酒假丝酵母菌(Candida sake)、掷孢酵母(Sporisoriu camicdor)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、毕赤酵母属galeiformis(Pichia galeiformis)、酒酵母(Kazachstania exigua)。对发酵过程中动态分析表明:Pichia spp.、Kazachstania spp.为传统发酵泡菜中主要的酵母菌。此外,两种不同发酵方式发酵过程中出现的酵母菌种类不同,但动态变化趋势大致相同。     

高通量测序方法研究传统四川泡菜母水中微生物群落的动态变化

为探明传统四川泡菜母水中的微生物群落及其变化规律,构建传统四川泡菜发酵模型,运用高通量测序方法对不同发酵阶段（20?代发酵）泡菜母水微生物群落组成和多样性进行分析。泡菜母水中的细菌群落主要包括7?个门,其中厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）分别占94.64%和2.73%,为优势菌门;真菌群落主要包括3?个门和1?个未分类种群,其中子囊菌门（Ascomycota）占99.93%,为优势菌门。泡菜母水中含量在0.1%以上的细菌属有7?个,主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）、拉乌尔菌属（Raoultella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、乳球菌属（Lactococcus）等;泡菜母水中的真菌属主要是Kazachstania,含量超过99%。通过分析不同发酵阶段泡菜母水中的微生物群落组成和多样性,结果表明随着发酵代数的增加,泡菜母水中的细菌与真菌多样性呈下降趋势,微生物群落构成趋于稳定：Lactobacillus是达到稳态的泡菜母水中的主要细菌属,Kazachstania是达到稳态的泡菜母水中的主要真菌属。     

新疆哈萨克族传统风干肉中真菌多样性分析

为明确新疆哈萨克族传统风干肉中真菌结构组成,采用Illumina MiSeq高通量测序技术对新疆传统风干肉样品中真菌内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS1)基因序列进行分析,比较新疆北疆地区不同来源风干肉中真菌群落结构组成,并对其进行差异性分析。结果表明,4个组26份样品共获得了1 936 392对有效的基因序列条带,371个运算分类单位(operational taxonomic unit,OTU),其中4组共有的OTU数目为84个,26份样品中共有的OTU数目仅为13个。真菌属水平检测结果表明,假丝酵母属(Candida) 30. 09%、Mrakia 16. 26%、德巴利酵母属(Debaryomyces) 11. 14%、球腔菌属(Mycosphaere) 6. 37%、青霉属(Penicillium) 4. 23%、曲霉属(Aspergillus) 2. 39%、Mrakiella 2. 88%、Naganishia 1. 71%和维希尼克氏酵母(Vishniacozyma) 1. 55%为优势菌群。新疆传统风干肉中真菌菌群具有丰富的多样性,且大部分菌群对肉的发酵起到积极作用,高通量测序技术能够很好地对传统风干肉中真菌多样性监测。     

酱香型白酒高温大曲发酵过程中真菌多样性研究

基于传统可培养方法和单分子实时测序技术对酱香型白酒仿生机制曲和传统人工曲发酵过程真菌群落组成及特征进行了研究。结果表明Wicherhanmomyces anomalus,Pichia kudriavzevii,Candida tropicalis,Kodamaea ohmeri,Kazachstania humilis,Kluveromyces marxianus和Aspergillus属丝状真菌可以同时被两种方法检出,从曲坯成型入仓到发酵结束出仓,真菌多样性呈现逐渐降低的趋势。同时,与二代高通量测序结果相比,单分子实时测序技术在种水平上更适合于小类真菌多样性的鉴定。此外,高温大曲多数优势真菌属之间呈显著正相关调节机制,其中包括55个真菌属呈现显著正相关,6个真菌属呈显著负相关。本研究揭示了酱香型白酒高温大曲制作过程真菌群落组成及其特征,旨在为挖掘高温大曲中功能微生物及阐明高温大曲发酵机理奠定理论基础。     

鲊广椒真菌多样性及其对滋味品质影响的评价

采用Miseq高通量测序技术对鲊广椒真菌微生物的群落结构进行解析的基础上,使用电子舌对不同样品各滋味指标的相对强度进行测定,最终对真菌多样性与鲊广椒滋味品质进行关联性分析。结果发现,在门水平上,Ascomycota（子囊菌门）的平均相对含量高达99.97%。在属水平上,相对含量大于1.0%的真菌属分别为Candida（念珠菌属）、Eurotium（曲霉菌属）、Pichia（毕赤酵母属）、Fusarium（镰刀霉属）、Galactomyces（地霉属）、Cladosporium（分枝孢子菌属）、Debaryomyces（德巴利氏酵母属）和Guehomyces（久浩酵母属）,其平均相对含量分别为56.63%、10.12%、11.19%、2.67%、2.48%、2.21%、1.50%和1.01%。经皮尔森相关性分析发现优势真菌属与鲊广椒的苦味、涩味、后味A和后味B呈正相关。由此可见,真菌含量过高不利于鲊广椒滋味品质的形成。     

青菜泡菜工业发酵过程中微生物群落结构变化分析

采用PCR-DGGE和qPCR技术检测四川工业青菜泡菜发酵过程中微生物群落组成。细菌DGGE条带表明,工业青菜泡菜中含有2个门,分别是厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria);共有12个细菌属,包括乳杆菌属(Lactobacillus)、盐单胞菌属(Halomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)等,其中乳杆菌属的相对丰度最高,qPCR检测其含量为10~7～10~(11) copies/mL。真菌DGGE条带表明,工业青菜泡菜的真菌属有5个,分别是德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、柯达酵母属(Kodamaea)、Cystofilobasidium,其中德巴利氏酵母属的相对丰度最高。     

基于高通量测序和可培养方法的勐海发酵普洱茶真菌多样性分析

通过高通量测序技术和传统可培养方法跟踪分析了勐海百中堂茶厂普洱茶发酵过程不同阶段的真菌多样性,采用多相鉴定方法准确鉴定了可培养真菌的分类学地位。可培养方法共分离到真菌107株,包括11个属,16个种,优势种为琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、新黑曲霉(Aspergillus neoniger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、青霉(Penicillium sp.)、枝孢菌(Cladosporium sp.)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、伞枝横梗霉(Lichtheimia corymbifera)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)、法布里德巴利酵母(Debaryomyces fabryi)、布兰克假丝酵母(Candida blankii)。高通量测序共分析到真菌69个属,189个OTU,优势属包括枝孢菌属(Cladosporium)、芽生葡萄孢酵母属(Blastobotrys)、假丝酵母属(Candida)。结果显示,普洱茶发酵过程中前期真菌多样性较后期高,研究结果为发酵普洱茶微生物安全性评价及功能性分析奠定了基础。     

襄阳大头菜腌制液生物膜真菌多样性研究

采集了3个襄阳大头菜腌制液生物膜样品,使用Miseq高通量测序技术对其真菌微生物群落结构进行了解析。在门水平上,Ascomycota平均含量高达99.99%,相对含量大于1%的真菌属分别为Zygosaccharomyces,Pichia和Candida,其平均相对含量分别为56.10%,40.96%和2.32%。在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上,发现24个核心OTUs,其中OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)的累计平均相对含量为83.60%。由此可见,襄阳大头菜生物膜中的真菌微生物主要由隶属于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia构成,生物膜共有大量的核心真菌菌群。     

龙山地区干豆豉真菌多样性研究

采用MiSeq高通量测序技术对龙山县农家自制干豆豉中真菌菌群群落结构进行研究,结果表明该地干豆豉中有核心分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)113个,其所包含的序列占总序列数的64.68%;含量最高的核心优势真菌门为子囊菌门(Ascomycota),其次为担子菌门(Basidiomycota)和毛微门(Mucoromycota),三者累积平均相对含量高达96.32%;曲霉(Aspergillus)、假丝酵母(Candida)、毛孢子菌属(Trichosporon)、毕赤酵母(Pichia)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、接合糖酵母属(Yamadazyma)、耐碱酵母属(Galactomyces)和米根霉属(Rhizopus)作为核心优势真菌存在于所有样品中,不同菌群相互作用共同形龙山干豆豉独特的风味。说明龙山干豆豉中真菌丰富,有待进一步发掘与保护。     

普洱茶(熟茶)发酵过程各层间真菌群落的动态变化

为了阐明真菌类微生物在普洱茶熟茶固态发酵中的类群特点和变化规律,以高通量测序方法研究了普洱茶熟茶大规模生产中的各阶段不同层次共计22个样品的真菌多样性及群落变化。在整个固态发酵过程中,共检测到真菌10门(Phyla)、122属(Genera),在属水平上占据优势的真菌菌种包括:曲霉属(Aspergillus)、Blastobotrys属、根毛霉属(Rhizomucor)、嗜热真菌属(Thermomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、青霉属(Penicillium)、Rasamsonia属。结果表明,原料中的真菌类群与实际固态发酵开始后的真菌类群占比存在较大差异,真菌类群呈现集中性,前期以Aspergillus占据绝对优势,后期则以酵母类的Blastobotrys属占据优势地位。不同层间优势菌属基本一致,但相对含量、结构存在一定的差异,固态发酵上层最优势菌属演替速度高于中、下层。     

多代发酵泡菜母水微生物多样性及其理化指标动态研究

为探明多代发酵泡菜中微生物多样性及理化指标的动态变化情况,采用可培养方法分离鉴定各代泡菜母水中的微生物,同时测定泡菜母水中的总酸、pH、亚硝酸盐、有机酸等理化指标。结果表明:乳酸菌是泡菜母水中的优势细菌,主要由Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis和Lactobacillus citreum构成;酵母菌是优势真菌,主要包括Kazachstania exigua、Pichia membranifaciens、Candida tropicalis和Pichia kudriavzevii。随着发酵过程的持续,多代发酵泡菜及泡菜母水中亚硝酸盐含量逐渐降低,到后期稳定在0.63~0.81mg/kg之间,远低于我国酱腌菜产品中的亚硝酸盐限量规定的20 mg/kg。多代发酵泡菜母水中总酸总体呈现增加的趋势,由1代0.58 g/d L增加至后期0.9 g/d L左右。泡菜母水中的有机酸主要包括酒石酸、琥珀酸、乙酸和乳酸4种有机酸。乳酸和乙酸随着发酵代数的增加逐渐积聚增多,到后期基本维持稳定。     

浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中酵母菌菌群研究

充分解析并挖掘浓香型白酒糟醅中的酵母菌株资源,对五粮液发酵旺盛期中的糟醅进行高通量测序以及纯培养。其中通过高通量测序技术共检测出11个种属的酵母菌群,包括:Kazachstania exigua、Saccharomyces cerevisiae、Kazachstania humilis、Pichia kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Geotrichum silvicola。利用7种培养基筛选五粮液发酵旺盛期糟醅中的酵母菌株,通过合并共获得57株纯培养酵母菌株,通过26S rDNA序列鉴定,发现其分属于Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida glabrata和Candida rugosa。结果表明:浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母群体多样性丰富,但与高通量测序相比,纯培养法仅能分离到糟醅酵母群体中的少数种属,因此要充分挖掘浓香型白酒糟醅中的酵母菌株资源,还需进一步优化分离、培养方法。