冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法的建立及应用

本文研究了冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)的双抗体夹心酶联免疫检测方法(sandwich-ELISA法),以抗MTG兔多抗为包被抗体,抗MTG鼠单抗为检测抗体,再结合HRP标记的抗IgG1二抗,构成sandwich-ELISA检测方法,对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测,防止冷冻鱼糜原料掺假。实验结果表明,包被抗体的最佳工作浓度是2.00μg/mL,检测抗体的最佳工作浓度为0.10μg/mL,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:5000。方法的检测限为20 ng/mL,该检测方法在0.6 mg/mL~10 mg/mL范围内OD450值与MTG浓度的log值呈线性关系。建立掺假冷冻鱼糜样品模拟体系,测定其中MTG的添加量:MTG的添加回收率为94%以上,测定过程中回收率结果的板内变异系数为1.12%~4.02%,板间变异系数为5.43%~6.87%。经试验证明该方法灵敏度高,样品前处理简便,适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测。     

邻苯二甲酸二甲酯免疫层析快速检测试纸的研制

邻苯二甲酸酯类塑化剂是一类具有生殖毒性的环境激素类物质,通过违规添加或迁移而造成食品污染问题颇为严峻,开发适合现场的塑化剂快速监测方法非常重要。本研究以邻苯二甲酸二甲酯(DMP)为对象,建立了DMP的胶体金标记免疫层析检测试纸方法。采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了胶体金,将其标记DMP多克隆抗体,制备了金标抗体;采用棋盘法和单因素试验确定最佳包被浓度和二抗浓度分别为3000μg/mL和1600μg/mL,抗体浓度为稀释1.4倍,基于此建立了DMP免疫层析快速检测方法,其检测限为0.4μg/mL,5 min内肉眼可观察到检测结果,与其它结构功能类似物无明显交叉反应,特异性良好,白酒样品添加检测结果与GC-MS法相符。本法快速简单,稳定可靠,适用于实际样品中DMP的现场快速检测。     

亚硒酸钠和硒代蛋氨酸对人结肠腺癌细胞的毒性作用

探讨两种硒化物对人结肠腺癌Caco-2细胞的毒性作用。将Caco-2细胞暴露在不同浓度的亚硒酸钠(SeIV)和硒代蛋氨酸(SeMet)中培养24 h,用Annexin V-FITC/PI双染色法检测在同样浓度的SeIV和SeMet培养下细胞的凋亡率,并设置不做硒处理的空白对照。用MTT法检测细胞存活率;检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞内的超氧化物歧化酶SOD活力和谷胱甘肽GSH的含量。相同浓度时(0.8μg Se/mL),与对照相比,SeIV诱导细胞凋亡显著率上升(p0.05),SeMet变化不显著。一定浓度的SeIV(≥0.4μg Se/mL)和SeMet(≥40μg Se/mL)与对照组相比均显著降低细胞的存活率(p0.05);随着Se含量的升高细胞的存活率呈下降趋势,SeIV、SeMet的IC_(50)分别为2.56、215.55μg Se/mL。当SeIV浓度为≥0.8μg Se/mL,SeMet浓度为≥40μg Se/mL时,细胞的LDH释放率均显著高于对照组(14.80%)(p0.05)。当SeIV浓度≥4μg Se/mL,SeMet≥4μg Se/mL时,细胞的SOD活性均显著低于对照组(56.76 U/mg prot)(p0.05)。当SeIV浓度≥4μg Se/mL,SeMet浓度为160μg Se/mL时,细胞的GSH含量均显著低于对照组(61.67μg/mg prot)(p0.05)。一定浓度的SeIV和SeMet会使Caco-2细胞产生氧化应激而导致细胞毒性,诱导细胞凋亡。     

反相液相色谱法测定发酵虫草菌粉腺苷含量

通过样品处理及检测条件的优化,建立发酵虫草菌粉腺苷含量的RP-HPLC检测方法.结果表明:Agilent-C18柱(4.6mm×300mm,5μm),乙腈+甲醇+水=5+5+90(体积比)作为流动相,检测波长260nm,流速为1.2mL/min,柱温35℃,进样量为20μL,腺苷浓度在10μg/mL～50μg/mL时,浓度与峰面积呈线性关系,最低检出浓度为1.2μg/mL,定量限为4.0μg/mL,加标回收率为95.30％～105.20％,相对标准偏差为2.32％～5.70％.     

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。     

优化青花椒多酚提取工艺及多酚成分测定和抗氧化性研究

以青花椒为原料,乙醇为有机溶剂,提取青花椒中的多酚,通过单因素实验(多酚提取温度、多酚提取时间、料液体积比、乙醇提取浓度)和正交实验联合确定提取青花椒多酚的最佳条件为:乙醇提取浓度40%,提取温度55℃,提取时间60min,料液比1∶30(g/mL),同时进行了青花椒多酚的组成及其抗氧化性能的研究。结果表明,检测出青花椒多酚纯化物样品中共含有5种成分,分别为表儿茶素(3.026μg/mL)、对香豆酸(0.975μg/mL)、阿魏酸(0.888μg/mL)、槲皮素(5.434μg/mL)、山奈酚(1.476μg/mL),检测了青花椒多酚的抗氧化能力,青椒多酚的抗氧化能力较强。     

牛奶中三聚氰胺的ELISA检测研究

戊二醛法将三聚氰胺(Melamine)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原Melamine-BSA及包被抗原Melamine-OVA.对人工合成抗原进行紫外扫描,其紫外扫描谱图与载体蛋白及三聚氰胺的图谱有明显的差异,初步显示载体蛋白与三聚氰胺偶联成功.进一步分析Melamine-BSA中Melamine与BSA的摩尔比,复合物中三聚氰胺与BSA的摩尔比为8.56 ∶ 1.用免疫抗原Melamine-BSA腹腔免疫BALB/c小白鼠,获得抗三聚氰胺的多克隆抗体,间接非竞争ELISA分析所得抗血清的效价达10000以上.间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别三聚氰胺,与氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺无交叉反应.利用自制抗体建立牛奶中三聚氰胺的间接竞争ELISA检测方法,对奶样作0.1μg/mL,1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL,500μg/mL和1000μg/mL六个加标浓度的回收率在70.30%113.59%.     

量子点标记荧光免疫法检测过氧化氢酶

通过制备量子点标记过氧化氢酶的荧光探针,建立过氧化氢酶荧光免疫分析方法。通过碳二亚胺法,合成了过氧化氢酶-量子点荧光探针,对活化剂添加量、体系pH等荧光探针的合成条件及免疫分析检测中抗体浓度、封闭液BSA浓度、反应时间等参数进行优化,用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果表明,活化剂的最佳添加量10μL、体系最佳pH 7.4、抗体的最佳浓度1μg/mL、封闭液BSA最佳浓度1%、反应时间60 min。方法检测范围为1～1 000μg/mL,相关系数R~2为0.994 2,最低检测限为2.5×10~(-2)μg/mL,批内、批间变异系数低于15%,具有良好特异性,样品的加标回收率高于90%。方法操作简单、准确度高、线性范围宽,为过氧化氢酶含量检测提供方向。     

雷洛昔芬抗体的制备及ELISA方法的初步建立

本文主要研究了雷洛昔芬抗体的制备和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)方法的初步建立。实验中采用丁二酸酐对雷洛昔芬进行衍生,合成了雷洛昔芬半抗原。采用碳二亚胺法,将雷洛昔芬半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成免疫原和包被抗原,并通过紫外光谱进行鉴定,结果显示雷洛昔芬与载体蛋白偶联成功。免疫大白兔制备了雷洛昔芬抗体,抗体效价达1.28×10~5,半数抑制浓度(half inhibit concentration,IC50)15.4μg/L,与其他类似抗雌激素药物没有交叉反应,说明所制备的抗体特异性好。通过优化抗原抗体反应浓度初步建立了雷洛昔芬ELISA方法,结果显示最佳抗原浓度为300μg/L,最佳抗体工作浓度为1:1.0×10~5,标准曲线在0.4~102.4μg/L范围内线性关系好,R~2=0.9853,最低检测能力0.4μg/L。本研究为进一步开发雷洛昔芬快速检测试剂盒提供了技术参考。     

二维液相色谱同时测定婴幼儿配方乳粉中多种脂溶性维生素

建立二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中维生素A、维生素E、维生素D_2、维生素D_3及β-胡萝卜素含量的方法。样品经皂化后以石油醚提取,经旋转蒸发浓缩后以乙腈/甲醇/四氢呋喃(75∶25∶5,体积比)定容,以二维液相色谱同时分析维生素A、维生素E、维生素D_2、维生素D_3及β-胡萝卜素,以InfinityLab Poroshell 120 EC-C8(3.0 mm×150 mm,2.7μm)为一维色谱柱,流动相乙腈/甲醇/四氢呋喃(75∶25∶5,体积比)-水/四氢呋喃(95/5,体积比)0.6 mL/min梯度洗脱,以Zorbax Eclipse PAH(4.6 mm×250 mm,5μm)为二维色谱柱,流动相甲醇0.3 mL/min,柱温25℃,一维DAD检测器采用波长切换方式检测(VA∶325 nm;VE∶294 nm;β-胡萝卜素:450 nm),二维DAD检测器检测((维生素D_2与维生素D_3∶264 nm)。)。结果维生素A在0.0945μg/mL～14.17μg/mL浓度范围内线性关系良好,维生素E在1.21μg/mL～181.5μg/mL浓度范围内线性关系良好,β-胡萝卜素在0.0163μg/mL～2.445μg/mL浓度范围内线性关系良好,维生素D_3在0.0163μg/mL～2.445μg/mL浓度范围内线性关系良好,维生素D_3在0.0150μg/mL～2.500μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数r大于0.999。分析时间为25 min。本方法可快速准确测定婴幼儿配方乳粉维生素A、维生素E、维生素D_2、维生素D_3及β-胡萝卜素。