重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。rBTI的相对分子质量约为11kDa,等电点约为6.2。rBTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比(以BApNA为底物)为1:1.5。rBTI的最适pH值为8.0,在pH3.0～8.0之间有较好的热稳定性,100℃加热120min仍保持70%的胰蛋白酶抑制活性。     

草鱼胰蛋白酶的亲和纯化及酶学性质

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明：草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数Km为3.4×10－5 mol/L;最适反应温度为60 ℃,在低于60 ℃条件下稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0～12.0;Ba2＋、Mg2＋、Fe2＋在0～10 mmol/L范围内对该酶具有一定激活作用,而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）、K＋在0～10 mmol/L范围内对该酶有一定抑制作用,EDTA较K＋对酶的抑制作用更明显。     

黑豆胰蛋白酶抑制剂的纯化及性质研究

目的:分离、纯化一种黑豆胰蛋白酶抑制剂,并进行酶学性质及其生物学性质研究,为其生物活性蛋白的研究提供依据。方法:采用硫酸铵分级沉降、弱阳交换色谱CM-Sephadex C-50、亲和色谱Affi-gel和SDS-PAGE等方法分离、纯化和鉴定;以BANPA为底物,检测BSTI对胰蛋白酶的抑制活性。结果:从黑豆种子中分离到一种胰蛋白酶抑制剂,命名为BSTI。SDS-PAGE和阴离子高效液相色谱鉴定表明该蛋白具有相当高的纯度。其相对分子质量为20 kD,等电点为5.6。当抑制剂与酶的物质的量比达到1时,使酶完全失活。在温度65℃以下以及经pH 2～10处理后,BSTI活性几乎不受影响。BSTI对植物致病菌苹果轮纹病菌、瓜果腐霉病菌和白菜黑斑病菌具有较强的抑制作用,而对甜瓜枯萎病菌和葡萄灰霉病菌无抑制作用。结论:本文分离、表征到一种具有抗菌活性的新型胰蛋白酶抑制剂,可以使用离子交换层析柱进行分离、纯化。     

磁性亲合分离法纯化胰蛋白酶

采用壳聚糖包埋纳米钡铁氧体,经环氧氯丙烷交联制得磁性亲和载体,应用激光粒度分析仪和振动样品磁性测定仪对磁性亲和载体进行表征,动态激光散射分析结果表明,磁性粒子的平均直径为401纳米.磁性测量表明,超细磁粉具有较高的磁性.然后利用碳二酰亚胺活化法,将抑肽酶与此微粒共价结合得到磁性亲和吸附剂,应用于胰蛋白酶的亲和纯化.论文详细讨论胰蛋白酶亲和纯化条件,将磁性亲合分离法成功地应用于亲和纯化胰蛋白酶.     

固定化胰蛋白酶壳聚糖树脂的制备及其对大豆胰蛋白酶抑制剂的吸附性

通过反向悬浮交联法制备了壳聚糖树脂,采用环氧氯丙烷活化,对树脂固定胰蛋白酶进行研究。通过正交设计实验,优化了壳聚糖树脂的活化、偶联条件;结果表明,4.0g壳聚糖树脂,加入1.6mL环氧氯丙烷,8.0mL1.0mol/LNaOH,活化温度60℃、偶联温度30℃时,胰蛋白酶可达到较大偶联量,偶联量为24.63mg/g壳聚糖树脂;添加硼氢化钠4.0mg,1,4-二氧六环6.0mL时,可将壳聚糖树脂的活化效果分别提高2倍、1倍。固定化酶活性检测表明,胰蛋白酶已成功地偶联到壳聚糖树脂上,并具有亲和吸附胰蛋白酶抑制剂活性,对大豆胰蛋白酶抑制剂的清除率约为33.3%。此固定化胰蛋白酶树脂可作为一种新型、廉价的亲和载体材料。     

豆类胰蛋白酶抑制剂抗鲢鱼鱼糜凝胶劣化的研究

为改善鲢鱼鱼糜凝胶特性,以野生及市售大豆为原料,利用等电点沉淀法制备了豆类胰蛋白酶抑制剂提取物,研究其对鲢鱼鱼糜凝胶劣化的影响。结果表明,等电点沉淀提取法可有效地分离胰蛋白酶抑制剂与其它大豆蛋白;与空白对照相比,添加0.5%～1.0%胰蛋白酶抑制剂提取物的鲢鱼鱼糜凝胶,自溶降解速度和蛋白溶解度明显受到抑制,且保水能力和凝胶强度显著增强;胰蛋白酶抑制剂通过抑制组织丝氨酸蛋白酶活性而抑制鱼糜凝胶的劣化。豆类胰蛋白酶抑制剂提取物的应用属低浓度范围,可广泛应用于鲢鱼、草鱼、带鱼等各种鱼糜制品的品质改善。     

白姑鱼胰蛋白酶的分离纯化及其性质分析

本研究从白姑鱼幽门垂组织中提取胰蛋白酶粗酶,然后经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离纯化技术,得到一种阴离子型胰蛋白酶（命名为：Trypsin A）,并对该阴离子型胰蛋白酶进行鉴定及性质分析。结果表明：Trypsin A的分子质量约为28 kD,其最适反应温度为50 ℃,能在低于65 ℃条件下保持稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 9.5～11.0;Western blotting分析表明,白姑鱼阴离子型胰蛋白酶可以与抗鲫鱼胰蛋白酶抗体反应,符合胰蛋白酶活性区域的高度保守性;丝氨酸类蛋白酶抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶具有抑制作用。     

大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

采用盐析、等电点沉淀、DEAE-Cellulose-32离子交换柱层析纯化大豆胰蛋白酶抑制剂,电泳测定其相对分子量为20.1 ku,BAEE(苯甲酰-L-精氨酸乙酯)法测定抑制比为0.9:1.纯化后的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)可以作亲和层析纯化丝氨酸蛋白酶的配基.     

大豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及其对凡纳滨对虾类胰蛋白酶的抑制作用

凡纳滨对虾的虾头中类胰蛋白酶活性高,死后自溶引起的组织软化大大降低了其商品价值。为了减少品质下降带来的不利影响,通过大豆胰蛋白酶抑制剂来抑制凡纳滨对虾的类胰蛋白酶从而达到提高品质的目的。首先,通过30%~80%硫酸铵沉淀、Q-Sepharose F.F阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析从凡纳滨对虾中提取了类胰蛋白酶,其分子质量为32.6 k Da。通过粉碎、脱脂、0.15 mol/L Na Cl提取,再进行热变性、超滤、Sephacryl S-100凝胶过滤层析纯化得到大豆胰蛋白酶抑制剂,该抑制剂分子量为16 k Da,得率为28.95%,纯化倍数达12.51,为电泳纯。实验结果表明,该抑制剂能抑制凡纳滨对虾类胰蛋白酶的活性,其抑制类型为不可逆抑制。     

微波法高效制备固定化胰蛋白酶

为探讨高效制备固定化酶的方法,研究采用微波固定化的方法来提高共价固定化过程的效率。以D151树脂为载体,采用中心组合设计响应面法优化制备固定化胰蛋白酶的条件。通过二次多项式回归方程的拟合,最终确定了制备固定化胰蛋白酶的最佳条件为:吸附时间1.5 h、戊二醛质量分数1.0%、加酶量8.2 mg/mL、pH 5.0、交联温度29.0℃及交联时间3.5 min。制备的固定化胰蛋白酶在25～45℃的温度范围内、pH在4.0～5.0和9.0～10.0范围内具有良好的稳定性;重复使用8次后,酶活力保留了初始酶活力的73.1%;储藏5周后酶活力仍保留了71.1%。进一步使用固定化胰蛋白酶水解酪蛋白,其效率比使用游离胰蛋白酶的水解效率更高。结果表明,采用微波辅助固定化胰蛋白酶是一种值得尝试的高效方法,制备的固定化胰蛋白酶也具有良好的催化性能。     

rBTI的制备及其对果蝇寿命的影响

构建含荞麦胰蛋白酶抑制剂（rBTI）表达质粒pExSecI-BTI的工程菌,在100 L发酵罐中放大发酵,发酵产物经热处理及离子交换层析纯化后,获得rBTI产品,其纯度达到95%以上。用含不同质量浓度rBTI（0、20、50 μg/mL）的培养基饲养果蝇,并分别检测果蝇的最高寿命,平均寿命和半数死亡时间等。初步研究rBTI对果蝇寿命的影响。结果显示,rBTI能够显著延长果蝇的寿命。在实验剂量范围内,果蝇的寿命与rBTI质量浓度呈现正相关。抗氧化酶活性检测发现,实验组果蝇体内的SOD和CAT活性均显著升高。rBTI延缓果蝇衰老的作用可能是通过刺激机体的氧化应激能力来实现的。     

Preparation of trypsin‐immobilised chitosan beads and their application to the purification of soybean trypsin inhibitor

BACKGROUND: Trypsin inhibitors are among the most important antinutritional factors in legumes. Recent research has shown that soybean trypsin inhibitor (SBTI) exhibits multiple bioactivities, but very few studies on the purification of SBTI are available. Enzymes are commonly used as biospecific ligands in affinity purification of their substrates or inhibitors. The aim of the present study was to prepare trypsin (EC 3.4.21.4)‐immobilised chitosan beads and use them to purify trypsin inhibitor from soybean whey. RESULTS: Compared with free trypsin, the immobilised trypsin had higher thermal and pH stability. The adsorption ratio of SBTI from crude SBTI aqueous solution by trypsin‐immobilised chitosan beads was 33.3%. The purified SBTI obtained by affinity chromatography was characterised by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis as a single polypeptide band with an M_r of 8.3 kDa belonging to the Bowman–Birk family. CONCLUSION: Trypsin‐immobilised chitosan beads were effectively used in the affinity separation of trypsin inhibitor from soybean seeds, thus indicating that immobilised trypsin may have practical application in the soybean‐processing industry. The results of this study provide a background for further investigation of potential applications of soybean bioactive constituents in the areas of agriculture and food. Copyright © 2008 Society of Chemical Industry     

Biochemical Characterization of a Low Trypsin Inhibitor Soybean

A low trypsin inhibitor soybean (LTI) was characterized using electrophoresis, enzyme activity measurements, and gel exclusion chromatography. The protein profiles were similar to a control soybean. Gel exclusion chromatography resulted in two peaks of trypsin inhibitor activity in the control. The first peak, absent in LTI, proved to be Kunitz trypsin inhibitor and was electrophoretically isomorphic. The second inhibitor consisted of at least five isotypes and co-eluted with Bowman-Birk trypsin inhibitor. Shorter heating times were required to inactivate both trypsin and chymotrypsin inhibitor activity in LTI compared to control soybeans. The use of LTI may increase the economic viability of soybeans as protein supplements for humans.     

Proteins and trypsin inhibitor activity of guar (Cyamopsis tetragonoloba L. Taub) seed

Proteins soluble in tris-acetate buffer (pH9.0) were fractionated by DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50 and Sephadex G-200 column chromatography. The purified proteins which contained 5–6% carbohydrate, had molecular weights of 125 900 and 22 390 amu. The high molecular weight fraction was homogeneous by polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins extracted in phosphate buffer (0.1M , pH7.6) when subjected to Sephadex G-200 gel chromatography were resolved into three fractions, all of which showed considerable trypsin inhibitor activity. Germination for 3 days reduced the trypsin inhibitor activity of the seed by about 30%.     

Purification and Partial Characterization of Trypsin from the Viscera of Tropical Sierra (Scomberomorus Sierra) from the Gulf of California

Trypsin from the viscera of sierra (Scomberomorus sierra) was purified by affinity chromatography on Sepharose‐4B coupled to soybean trypsin inhibitor and characterized with respect to its purity, sensitivity to temperature, pH and inhibition. Trypsin was purified from sierra viscera with 11.9‐fold and 29.7% yield. The enzyme had a molecular weight of 25.4 kDa estimated by SDS‐PAGE and two possible trypsin isoforms were observed in activity gels. Trypsin activity was strongly inhibited by soybean trypsin inhibitor and porcine trypsin inhibitor, showing a partial inhibition by a serine protease inhibitor. The optimal activity of the enzyme was observed at pH 9 and 60C with n‐α‐benzoyl‐dl‐arginine‐p‐nitroanilide as a substrate. The enzyme maintained more than 50% of its activity in temperatures up to 50C and within the pH range of 8–10 for a period of up to 2 h.     

苦荞凝集素的稳定性及体外消化性

目的:从苦荞种子中分离得到一种凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL),研究其酸碱、热稳定性及体外消化性。方法:采用酸性缓冲液浸提脱脂荞麦粉及阴离子交换层析纯化凝集素,TBL分别经沸水浴加热不同时间、不同pH处理、模仿胃液、模仿胰液消化后,采用SDS-PAGE及灰度扫描分析,研究其稳定性及体外消化性。结果表明:选用pH4.7浸提缓冲液可简化提取工艺,采用一步层析可得到电泳纯TBL。沸水浴加热60 min时,TBL仍可保留50%以上。在pH4~12条件处理30 min后,BTL的保留率均在80%以上。体外消化实验表明,TBL对人工模拟胃液有一定抗性,降解一半TBL所需时间为10 min,而TBL在人工模拟肠液中很难消化,即使作用时间为50 min时,TBL也未发生明显降解。将TBL沸水浴加热30 min后再进行体外消化实验,发现在模拟肠液及模拟胃液中,仅处理10 min时,SDS-PAGE结果中TBL蛋白条带完全消失,表明被TBL被消化酶完全降解。结论:天然TBL具有良好的稳定性,耐热、耐酸碱、耐胰蛋白酶消化,在胃蛋白酶液中降解也较为缓慢。预加热处理可明显提高TBL在模拟胃液及模拟肠液中的消化率。     

固定化酶法分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂

大豆分离蛋白生产中的大豆乳清废水中含有多种生理活性成分,其中大豆胰蛋白酶抑制剂可作为癌症和糖尿病治疗的药物。利用固定化胰蛋白酶分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂可得到高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂。研究结果表明:大豆胰蛋白酶抑制剂通过各阶段纯化后其活性从0.95TIU/mL增高至325.5TIU/mL,纯化程度提高324.6倍,得率0.033%;电泳结果表明:利用固定化胰蛋白酶分离纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂有单一谱带,纯化效果明显。     

降解大豆胰蛋白酶抑制剂的短小芽孢杆菌菌株及其胞外蛋白的鉴定

本研究以大豆胰蛋白酶抑制剂为唯一碳源,从豆类内部筛选获得3株具有降解大豆胰蛋白酶抑制剂的细菌。通过对菌株的16Sr DNA基因的分析,3株细菌分别被鉴定为枯草芽孢杆菌LZ013-1、短小芽孢杆菌LZ013-2和类芽孢杆菌LZ013-3。进一步研究发现LZ013-2菌株的上清液具有高效降解大豆胰蛋白酶抑制剂的活性,2h可将胰蛋白酶抑制剂抑制率降低73.60%。将LZ013-1和LZ013-2菌株应用于豆粕发酵中,两株芽孢杆菌均能高效降解胰蛋白酶抑制剂。原始豆粕的胰蛋白酶抑制剂活性为22.26 mg/g,经过LZ013-1和LZ013-2菌株的液态发酵后分别降低为0.50 mg/g和0.63 mg/g,经过固态发酵后分别降低为1.06 mg/g和1.03 mg/g。通过硫酸铵分级沉淀和凝胶柱层析,分离LZ013-2菌株发酵上清液中具有降解活性的蛋白质,并采用质谱鉴定分离得到的蛋白质,筛选并鉴定出2种活性蛋白,分别为肽酶S8(Uniprot ID:A0A2T0DB16)和肽酶M84(Uniprot ID:A8FIH7)。