n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血液外泌体中miRNA的调节和抑制肥胖作用

目的：研究体内n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）含量的增加对小鼠体质量和血液中外泌体miRNAs表达的影响,探讨n-3 PUFAs通过外泌体抑制肥胖的作用机制。方法：利用能自发生成n-3 PUFAs的fat-1转基因小鼠和同窝野生型小鼠（对照）,通过高脂饮食（high-fat diet,HFD）建立肥胖动物实验模型,测定小鼠体质量。提取小鼠血浆中的外泌体并鉴定;分离外泌体内的RNA,构建文库并进行miRNA高通量测序。根据测序结果通过生物信息学方法分析找到其调控的靶基因和相关联的通路,发现miRNA-靶基因互作关系。验证miRNA与肥胖的关联度以及在肥胖中所发挥的作用。结果：fat-1转基因小鼠体质量明显低于野生型;外泌体提取鉴定成功;miRNA高通量测序结果显示,不同小鼠组间进行对比时,差异表达显著（P＜0.05且差异倍数（fold change,FC）≠1）的miRNA有46 个;生物信息学分析发现6 个重要miRNA（mmu-miR-665-3p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122-3p、mmu-miR-194-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-223-3p）落在脂肪酸代谢通路以及内吞通路关键位置,功能与脂质代谢和肥胖相关,所对应的靶基因分别为Fads1、Elovl2、Elov6、Hadha、Scad1、Scad2、Hsd17b12、Acot2、Acot4和Arf6、H2-T-ps、Arrb1、Ist1、H2-T10、Wwp1、Snx4、IL2rb、Mvb12b、Rab11、fip3、Kif5a、Nedd4l。结论：n-3 PUFAs含量的增加能够有效降低小鼠的体质量,抑制肥胖。n-3 PUFAs能够调节血液中外泌体内miRNA的表达,其中具有显著差异性的miRNA与肥胖有关,其相关的靶基因集中在脂质代谢相关的分子通路中,提示可能是n-3 PUFAs降低体质量抑制肥胖机制之一。     

不同泌乳期人乳外泌体miRNA表达谱的研究

采用超高速离心法从人乳中提取出囊泡结构物质，从粒径、形态和外秘体特异性标记蛋白3个方面来确定提取的物质为外泌体。采用高通量测序得到不同泌乳期外泌体中microRNA(miRNA)的表达谱。对表达谱进行分析，在人乳外泌体中共检出852种miRNA，有283种miRNA在早、中、晚3个泌乳期中均有所表达。其中，表达量排名前10位的miRNA占到总量的50%以上。在外泌体中高表达的miRNA(占总外泌体miRNA表达量2%以上的)并没有受到泌乳期的显著影响；而在外泌体中低表达的一些miRNA(占总外泌体miRNA表达量0.01%以下的)容易受到泌乳期的显著影响。此外，发现在人乳外泌体中有88种miRNA与炎症相关，其中有65种在不同泌乳期均稳定表达。综上，人乳外泌体可能具有调控炎症的功能，本研究为更好地研究不同泌乳期人乳外泌体生理功能提供基础数据。     

山羊乳及绵羊乳外泌体miRNAs表达谱的分析与差异比较

为揭示山羊乳和绵羊乳外泌体的潜在功能差异，对山羊乳和绵羊乳外泌体进行提取和鉴定，利用Illumina平台对羊乳外泌体中非编码小RNA(sRNA)进行高通量测序，并对微小RNA(miRNA)表达谱和功能进行注释。在山羊乳外泌体中鉴定出161种已知miRNAs序列和5种新型miRNAs序列；绵羊乳外泌体中鉴定出80种已知miRNAs序列和7种新型miRNAs序列，其中miR-148a、miR-26a和let-7b在2种羊乳样本中表达量较高。miR-151只在山羊乳外泌体样本中检出。通路富集发现山羊乳miRNAs靶基因分子功能集中在结合和催化活性等方面，而绵羊乳外泌体miRNAs靶基因具有肠菌素结合的功能，且对宿主发育具有一定促进作用。结果提示山羊乳和绵羊乳来源的miRNAs可能具有某些共性和独特的靶基因类型，可能在缓解病原微生物感染、炎症、抑制癌细胞增殖迁移等方面发挥不同功能。上述miRNAs测序与分析研究可为羊乳外泌体的后续功能开发提供参考。     

牛乳外泌体中miRNA的测序与分析

采用密度梯度离心法提取牛乳外泌体，利用Illumina测序技术对外泌体中非编码小RNA(sRNA)进行测序，探索牛乳microRNA(miRNA)的表达谱。对原始序列进行质量控制，共获得3 899 629条纯净sRNA序列，长度集中于28 nt，与数据库比对后鉴定到61种已知miRNA,346种新miRNA。基因本体论富集结果表明，牛乳外泌体miRNA在细胞过程、单一生物体过程、代谢过程等生物过程发挥作用；主要构成细胞、细胞器等组成；主要参与结合、催化活性、转运蛋白活性等分子功能。京都基因与基因组百科全书通路富集结果表明，已知miRNA与新miRNA靶基因均显著富集在百日咳（ko05133）、趋化因子信号通路（ko04062）、内吞作用（ko04144）、溶酶体（ko04142）等通路，牛乳外泌体miRNA在特定信号通路中发挥重要作用。     

n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖及相关细胞因子的影响

目的：研究n-3 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fat acids,PUFAs)饮食对小鼠肥胖程度及相关细胞因子血清水平的影响,探讨其作用机理。 方法：将健康小鼠分为高饱和脂肪酸饮食组、n-3 多不饱和脂肪酸饮食组和对照组,记录每周小鼠进食量和体质量,实验结束时用ELISA 法检测小鼠血清增食因子A(orexin-A)、抵抗素(resistin)、脂联素(adiponectin)水平。 结果：n-3 多不饱和脂肪酸饮食组小鼠与高饱和脂肪酸饮食组小鼠相比,肥胖程度明显降低 (P ＜ 0.05),血清的增食因子A 水平明显降低(P ＜ 0.05),血清的抵抗素水平明显升高(P ＜ 0.05),血清的脂联素水平升高但无统计学差异;n-3 多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的各项指标和对照组相比均无统计学差异。结论：n-3 多不饱和脂肪酸饮食与饱和脂肪酸饮食相比,可抑制肥胖的发生和发展。     

n-3多不饱和脂肪酸对小鼠糖脂代谢影响及机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子(MyD88)/NF-κB通路探讨n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)改善小鼠糖脂代谢的机制。方法:40只SPF级C57BL/6雄性小鼠适应性喂养1周,随机分为4组:正常对照组、高脂猪油组(富含饱和脂肪酸)、高脂大豆油组(富含n-6多不饱和脂肪酸)和高脂亚麻籽油组(富含n-3多不饱和脂肪酸),持续饲喂9周后进行葡萄糖耐量实验,全自动生化分析仪测定血脂血糖相关指标,ELISA试剂盒测定相关炎症因子,RT-PCR检测各组小鼠脂肪组织中TLR4/MyD88/NF-κB通路相关基因表达水平。结果:与其他高脂组相比,高脂亚麻籽油组能显著降低血糖水平,提高血清胰岛素水平,降低血清甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平(P0.05);同时能下调TLR4/MyD88/NF-κB通路相关基因及炎症因子TNF-α、IL-6及IL-8的表达量。结论:n-3 PUFAs能够抑制高脂引起的小鼠糖脂代谢紊乱,抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路所介导的炎症反应可能是其作用机制。     

驴乳外泌体中miRNA的测序与分析

为探究驴乳外泌体中微小RNA（miRNA）的种类和功能性,利用Illumina测序技术对驴乳外泌体中非编码小RNA（sRNA）进行测序分析,鉴定其中的miRNA并以人乳外泌体miRNA作为对照组进行生物信息学分析。驴乳外泌体中sRNA在质量控制之后,长度主要分布在18～22 nt,在其中共鉴定到212 个miRNA,其中包括16 种已知miRNA和196 种新miRNA。基因本体论富集分析发现,驴乳外泌体miRNA的功能性与人乳相似,构成细胞、细胞器等组分;具有结合和催化活性等功能;参与细胞代谢、生物调节等过程。京都基因与基因组百科全书通路富集分析发现,驴乳外泌体miRNA参与醛固酮的合成与分泌、Hedgehog信号、线粒体调节、癌症等通路。     

烟草烟碱相关miRNA筛选及验证

为挖掘烟草中可能参与烟碱调控相关的miRNA,利用生物信息学方法,进行了烟草全基因组水平的miRNA鉴定,筛选出烟碱相关的miRNA,并利用qPCR和GC-MS技术对相关过表达miRNA材料开展了功能验证。结果显示,利用红花大金元3个时期5个不同组织(根、茎、叶、花和腋芽)共39个样品的miRNA测序数据,共鉴定出了2 925个miRNA,其中1 245个miRNA是已知的,包括43个烟草中已经报道的miRNA。过表达miR2635的材料靶基因NtQPT2表达量下降约48%～67%,过表达miRNA203材料的靶基因NtMATE1表达量下降达98%,两种过表达材料中平均烟碱含量分别降低了约69%和62%,表明miRNA2635和miRNA203可分别通过降低靶基因NtQPT2和NtMATE1的表达量进而降低烟草中的烟碱含量。     

不同比率n-6/n-3多不饱和脂肪酸对apoE基因敲除小鼠炎症相关因子表达的影响

目的研究不同比率n-6／n-3多不饱和脂肪酸饮食对模型小鼠脾脏和主动脉组织中炎症相关因子表达的影响。方法8周龄雄性apoE基因敲除小鼠分别经不同比率n-6／n-3（组1：1．28;组2：5．03;组3：9．98;组4：68．26）多不饱和脂肪酸分别饮食干预,全长主动脉经油红O染色显示动脉粥样硬化（AS）病变程度,用实时定量RT-PCR技术分析不同饮食组小鼠脾脏和主动脉中炎症相关因子的表达特征。结果随着饮食中n-6／n-3比率升高,小鼠动脉粥样硬化病变逐渐加重。与组4相比,组1,2,3饮食显著抑制AS病变（P〈0．05）,并显著抑制主动脉组织中趋化因子MCP-1和黏附因子VCAM-1基因表达（P〈0．05）。与组4相比,组1饮食显著抑制脾脏促炎因子IL-6和TNFα表达（P〈0．05）。各组饮食均不影响脾脏和主动脉中抗炎因子IL-4表达（P〉0．05）。结论低比率n-6／n-3多不饱和脂肪酸（1．28～9．98）饮食可通过抑制促炎因子IL-6、TNFα和趋化因子MCP-1、黏附因子VCAM—1基因表达延缓apoE基因敲除小鼠AS的发展。     

骆驼奶中外泌体对Ⅰ型糖尿病小鼠治疗的作用研究

为研究骆驼奶中外泌体对Ⅰ型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）小鼠血糖和体重的影响,该试验通过超高速离心的方法获得骆驼奶中外泌体,并对C57BL/6J小鼠饲喂高脂高糖饲料以及腹腔注射链脲佐菌素的方法建立Ⅰ型糖尿病（T1DM）小鼠模型。将小鼠随机分为正常对照组、模型组、双胍类药物组和外泌体组,对各组小鼠分别连续40 d灌服生理盐水、盐酸二甲双胍缓释片溶液以及外泌体溶液,并检测血糖浓度以及体重。结果显示,通过超高速离心的方法可以获得完整的外泌体;外泌体可显著降低Ⅰ型糖尿病小鼠的血糖浓度（P<0.01）,并能起到恢复小鼠体重的作用。结果表明,骆驼奶中外泌体可以降低血糖,为开发天然纳米药物提供依据。     

Differentially expressed plasma microRNAs in premature ovarian failure patients and the potential regulatory function of mir-23a in granulosa cell apoptosis

Recent studies implicate the regulatory function of microRNAs (miRNAs) in oocyte maturation and ovarian follicular development. Differentially expressed miRNAs are found in the plasma of premature ovarian failure (POF) patients and normal cycling women. In this study, miRNA-regulated signaling pathways and related genes were described using Gene Ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analysis. The effect of mir-23a on granulosa cell apoptosis was also studied by examining the protein expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and caspase-3, followed by subsequent counting of apoptotic cells after Hoechst 33258 staining. Both GO analysis and pathway analysis suggested that many signaling pathways, including the AKT signaling pathway, steroid hormone receptor signaling pathways, and others, were regulated by this group of differentially expressed miRNAs. A decrease in XIAP expression (mRNA and protein level) and caspase-3 protein levels and an increase in cleaved caspase-3 protein were observed in human ovarian granulosa cells transfected with pre-mir-23a, along with an increased occurrence of apoptosis. In conclusion, differentially expressed miRNAs in the plasma of POF patients may have regulatory effects on proliferation and apoptosis of granulosa cells by affecting different signaling pathways. Mir-23a may play important roles in regulating apoptosis via decreasing XIAP expression in human ovarian granulosa cells.     

Long Chain Omega-3 Fatty Acid Levels in Loin Muscle from Transgenic (fat-1 gene) Pigs and Effects on Lipid Oxidation During Storage

Studies suggest a diet rich in long chain omega-3 fatty acids (LCn3) can promote visual, neural and vascular health. Pork muscle typically has small amounts of LCn3. A transgenic technology involving the fat-1 gene has been developed to increase LCn3 in various pig tissues; however, pork loin muscle has not been examined to date. We have determined that the LCn3 content in loin muscle (Longissimus) from fat-1 pigs was 1.59–2.24 g/100 g lipid compared to 0.34–0.38 g/100 g lipid in control samples. Lipid oxidation products were measured in ground and salted loin muscle from control and fat-1 pigs during storage at ?4°C. There was no clear trend as to whether the fat-1 gene technology increased or decreased oxidative stability of the muscle during storage based on lipid peroxide and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) values. There were a greater number of volatiles detected in stored loin from fat-1 pigs compared to control. Volatiles common to control and fat-1 pigs were elevated in stored loin from fat-1 pigs. This is the first report indicating that the use of fat-1 transgenic technology significantly increases the amount of desirable LCn3 in pork loin muscle.     

苦瓜皂苷对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其机制研究

目的：研究苦瓜皂苷对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其与降脂作用的相关性。方法：结合油红O染色与甘油三酯生化试剂盒分析苦瓜皂苷（50、100、200 μg/mL）对线虫脂肪沉积的作用;通过测定线虫体长、体宽、运动能力以及寿命评估苦瓜皂苷对线虫基础生理指标的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测脂代谢相关基因的mRNA表达水平;利用脂代谢相关基因缺失的线虫突变株,通过系统寿命评估,考察苦瓜皂苷调控线虫寿命与脂代谢的相关性。结果：100、200 μg/mL苦瓜皂苷在不改变虫体大小、运动能力等基础生理指标条件下,能够显著降低线虫甘油三酯相对含量（P＜0.05）,并延长线虫自然寿命（P＜0.000 1）。经100 μg/mL苦瓜皂苷处理后,脂肪合成相关基因nhr-80、fat-5、fat-6和fat-7 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）,而对脂肪酸氧化或脂肪分解相关的基因无明显作用。经苦瓜皂苷处理后,fat-6、fat-7单突变体和fat-6/fat-7双突变体的寿命均无显著延长（P＞0.05）。结论：苦瓜皂苷延长线虫自然寿命的作用与其降低脂肪沉积的功效密切相关,其机制主要是抑制了脂肪酸合成途径中脱饱和酶fat-6和fat-7的基因表达。     

膳食补充n-3多不饱和脂肪酸保护大鼠衰老皮肤胶原的作用及机制研究

目的:探索膳食补充n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)对大鼠自然老化皮肤真皮胶原的保护作用及机制。方法:选取9月龄大鼠为年轻组,22月龄大鼠作为老化n-3 PUFAs组(膳食补充n-3 PUFAs)及老化对照组(膳食中脂质成分模拟日常饮食中成分作为对照)。通过HE染色、Masson染色及Weigert染色观察年轻组大鼠、老化n-3 PUFAs组和老化对照组大鼠真皮结构变化,ELISA检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量,RT-qPCR检测Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原和MMP1、MMP3、MMP9、MMP10、MMP13的mRNA表达量。结果:老化大鼠表皮较年轻大鼠变平变薄,真皮胶原排列紊乱,Ⅰ、Ⅲ型胶原含量显著减少(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原mRNA表达量显著下调(P<0.05)。老化n-3 PUFAs组中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及mRNA相对表达量均较老化对照组显著提高(P<0.05)。老化大鼠皮肤中MMP1、MMP9、MMP10、MMP13 mRNA相对表达量均较年轻大鼠显著增多(P<0.05),老化n-3 PUFAs组中MMP10、MMP13 mRNA相对表达量较老化对照组显著降低(P<0.05)。结论:膳食补充n-3 PUFAs可促进老化大鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原合成,减少MMP10、MMP13的表达,增加皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,延缓皮肤自然老化进程。     

摄食DHA-磷脂酰丝氨酸对发育期小鼠体组织DHA水平的影响

目的：比较研究断乳后干预二十二碳六烯酸-磷脂酰丝氨酸（docosahexaenoic acid-phosphatidylserine, DHA-PS）和DHA-甘油三酯（DHA-triglyceride,DHA-TG）对发育期ICR小鼠体组织DHA含量以及脂肪酸组成的影 响。方法：母鼠孕期及哺乳期喂饲n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）缺乏饲料,子代 雄小鼠断乳后随机分为3 组,分别喂饲n-3 PUFAs缺乏饲料（n-3缺乏组）、DHA-TG饲料（DHA-TG组）、DHA-PS 饲料（DHA-PS组）,每组8 只,喂养2 周后检测小鼠脑皮质、精巢、肝脏、红细胞中脂肪酸组成和DHA含量。结 果：补充DHA-PS和DHA-TG可以使发育期小鼠各组织中DHA含量显著增加（P＜0.05）,二十二碳五烯酸和花生四 烯酸含量显著降低（P＜0.05）。DHA-TG组精巢中DHA含量明显高于DHA-PS组;DHA-PS组肝脏TG、磷脂和红细 胞中DHA水平显著高于DHA-TG组（P＜0.05）,而两组脑皮质DHA水平无显著性差异（P＞0.05）。结论：膳食补 充DHA-PS和DHA-TG均可明显提高发育期小鼠各组织中DHA水平,但二者的组织蓄积特性不同,DHA-PS可以更 高效地提高小鼠肝脏和红细胞中DHA水平。     

油菜BnROP1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育

基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为At3G51300（AtROP1）,采用荧光定量PCR方法,对油菜中该基因（BnROP1）在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,在此基础上构建了AtROP1基因的microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得12株转基因苗。T1转基因植株大多出现角果数量减少或不结实、无花粉、花药萎缩以及小孢子数量大大减少的表型。对转基因T2多个株系的荧光定量PCR分析说明,目标基因的干扰是有效的,靶基因的表达水平都显著下调。说明转基因植株的雄性不育表型和ROP1基因的表达沉默有关,ROP1基因不仅控制了花粉管的极性和伸长,还和小孢子的正常发育密切相关。