限制性内切酶NcoI的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoI是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoI蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoI的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度>95%的NcoI野生型和Se-NcoI硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoI蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoI蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoI三维结构提供了基础。     

限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度95%的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础。     

变形杆菌属脂肪酶LipK107的分离纯化、结晶及初步晶体学分析

经过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导,重组大肠杆菌高效表达出带有组氨酸标签的可溶性脂肪酶LipK107。通过亲和层析和凝胶层析两步法纯化,得到电泳纯的脂肪酶样品。在获得的纯酶基础上,进行了圆二色谱实验,以分析脂肪酶LipK107的二级结构组成。接着,使用悬滴气相扩散法进行了纯酶的结晶实验,经过晶体生长条件的初步筛选及优化,在0.1mol/L pH6.2柠檬酸钠,10%v/v异丙醇,15%w/v聚乙二醇4000条件下得到高质量的脂肪酶晶体,使用同步辐射光源收集了一套分辨率为2.0的X-射线衍射数据。     

重组降血压肽ACEIP的表达及活性鉴定

选择降血压肽WQVLPNAVPAK，人工合成大肠杆菌密码子优化后六串联体血管紧张素转换酶抑制肽(angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP)基因片段ACEIP，将其克隆至表达载体pET30a后构建重组质粒pET30a-ACEIP。该重组质粒经限制性内切酶Nde I和HindIII双酶切鉴定、菌落聚合酶链式反应鉴定后，将其化转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建了表达工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-ACEIP。工程菌经终浓度为0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷导后，Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在分子质量约为8.7 kDa处出现一条明显条带。经Ni²⁺亲和层析、肠激酶酶切后纯化得到串联多肽ACEIP。其中融合蛋白的表达量为61.30 mg/L，串联多肽ACEIP的表达量为57.84 mg/L。串联多肽经胰蛋白酶酶解后的IC₅₀值为6.39 mg/m L,ACE抑制活性高于单体肽WQVLPNAVPAK的抑制活性(I...     

植物乳杆菌重组亚油酸异构酶的表达与纯化

对转化有植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的大肠杆菌进行诱导表达,表达出大量重组亚油酸异构酶蛋白,但大部分目的蛋白形成了包涵体,用8mol/L尿素将包涵体蛋白溶解变性后,用金属螯合层析对重组蛋白进行了纯化.当咪唑溶液浓度为50mmol/L时,重组蛋白开始被洗脱下来;当咪唑溶液浓度为200mmol/L时,蛋白洗脱效果最佳;浓度为400mmol/L时,重组蛋白完全被洗脱下来.纯化后重组蛋白的收率为84.71%.     

不同连接肽在硫酸软骨素酶 ABC I重组表达中的应用研究

硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接，并克隆到pMAL-c2X载体上，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)高效表达。结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白，重组酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子质量均为130 kDa，并且都为可溶性蛋白。     

植物乳杆菌NP_785232蛋白N端两个特定结构域在大肠杆菌中的诱导表达

以植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232为研究对象,采用外源重组表达的方法大量制备其前两个结构域。应用聚合酶链式反应方法克隆NP_785232蛋白N端的前两个结构域,将克隆获得的片段连入表达载体pET30a中构建重组质粒pET30a/N2,该重组质粒转化大肠杆菌后,用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷诱导重组菌,重组蛋白经HisTrap柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对电泳获得的目的大小的片段进行质谱鉴定。结果表明：获得的重组蛋白与NP_785232蛋白N端的前两个结构域完全相同。通过大肠杆菌表达系统可以有效表达植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232 N端的前两个结构域。     

李斯特菌噬菌体裂解酶CBD蛋白的克隆与表达

单核细胞增生李斯特菌噬菌体的裂解酶中细胞壁结合结构域(CBD)能够特异识别李斯特菌细胞。本研究将CBDP40基因扩增后插入p ET32a(+)载体,导入大肠杆菌表达系统,获得重组菌株,并对其进行IPTG诱导表达,分析重组蛋白的活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明,经0.1 mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)在38 ku处有明显诱导条带,与预期蛋白分子量相符。经过超声细胞破碎,重组蛋白CBDP40分布在上清液中,通过镍离子螯合亲和层析纯化重组蛋白,洗脱后的蛋白浓度为0.908 mg/m L。经菌体结合和间接ELISA验证,重组蛋白CBDP40具有生物学活性,即对李斯特菌具有识别功能。CBD蛋白的重组表达、纯化及其活性验证,为深入研究裂解酶的理化性质和作用机制奠定了基础。     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

高产洛伐他汀红曲菌的选育及其在红腐乳中的应用

硫酸软骨素酶（ChSase）是一类能将硫酸软骨素（CS）催化裂解为小分子多糖的酶,根据结合的底物种类可分为ChSase ABC,ChSase AC,ChSase B和ChSase C。将普通变形杆菌（Proteus vulgaris）KCTC 2579的硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达,构建了pMAL-c2x-ChSase ABC I重组载体,并成功在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)宿主中高效表达。将麦芽糖结合蛋白-硫酸软骨素酶（MBP-ChSase）ABC I固定在聚苯胺载体上,制备生物传感器,并利用循环伏安法对其进行检测。结果表明,MBP-ChSase ABC I酶活和比酶活分别为3 180 IU/L发酵液和76 IU/mg蛋白。选择硫酸软骨素A（CS A）作为酶的反应底物,在最适反应条件下,反应的峰值电流与CS A在浓度0.1 nmol/L～0.1 μmol/L范围内呈线性关系。该生物传感器对底物反应迅速,具有较高的灵敏度,可以进行有效检测。     

古细菌-硫细菌蛋白AF1514的纯化及晶体生长研究

本研究将AF1514蛋白的重组基因转化到大肠杆菌（E．coliBL21）并通过在12℃条件下的诱导表达产生了大量的目的蛋白。用镍柱亲和层析和分子筛Superdex．75凝胶过滤层析的两步蛋白纯化方法进一步纯化蛋白AFl514后,获得纯度较高的蛋白（纯度〉95％）。纯化的母体蛋白和甲基化处理后的蛋白衍生物分别用悬滴汽相扩散法在16℃结晶。初步筛选所用的400多种结晶条件中,适合晶体生长的条件只有3种,其中最佳晶体生长条件溶液的成分包含0．1mol／L醋酸钠,pH5．0,0．1mol／L氯化钠和8％～14％（W／V）2．甲基2,4．戊二醇。蛋白晶体属于四方晶系,初步x．射线衍射分辨率为2．09A°。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

李斯特菌噬菌体裂解酶基因在大肠杆菌中的表达

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性致病菌,存在于多种环境中,造成牛奶、肉类、水产品等的食品安全问题。李斯特菌噬菌体编码的裂解酶能够特异性地裂解宿主细胞,释放胞内的子代噬菌体。本研究旨在构建李斯特菌噬菌体A500裂解酶的细胞壁结合结构域CBD500的异源表达系统,获得重组蛋白。首先通过体外扩增得到CBD500基因,克隆到表达载体p ET32a(+)中,转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)。阳性重组菌在30℃,0.1 mmol/L IPTG中诱导4 h后,以可溶形式表达分子质量约35 ku的重组蛋白。利用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,纯化产物质量浓度为0.62 mg/mL。间接ELISA试验证实,纯化的重组蛋白具有生物学活性,可用于进一步研究裂解酶的理化性质和作用机制。     

重组牛乳过敏原β-乳球蛋白的可溶性表达及其特性分析

目的 实现β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, BLG)的可溶性表达,并比较重组BLG和天然BLG在结构和免疫原性两个方面的差异性。方法 将pET-30a-BLG重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达,并对表达条件进行优化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性。利用荧光光谱和圆二色谱比较重组BLG空间结构变化,同时采用竞争抑制酶联免疫吸附实验评价重组BLG致敏性能力。结果 在Tris-HCl溶液体系中重组BLG的可溶性表达可达到50%以上,可溶性表达的最优条件为:在Tris-HCl溶液体系中,诱导温度为37℃, IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导4 h。重组BLG表面疏水性下降,可溶性重组BLG的α-螺旋结构减少,经除盐处理后致敏性下降,包涵体重组BLG无规则卷曲结构减少、致敏性上升。结论 本研究成功从上清液中纯化得到可溶性重组BLG,且可溶性表达获得的BLG空间结构更接近天然蛋白。     

降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功. PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDSPAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31 000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

菠萝泛菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶活性分析

利用分子克隆的方法,对一种源于菠萝泛菌的内切葡聚糖酶(即β-1,4-内切葡聚糖酶)基因进行克隆、原核表达,利用Ni-NTA吸附柱对表达的重组内切葡聚糖酶进行纯化,分析重组酶的活性。研究结果显示,此重组内切葡聚糖酶含1个1 002 bp的开放阅读框,编码334个氨基酸序列,重组酶在大肠杆菌细胞中的表达量占可溶性蛋白的50%以上,经过纯化获得了纯度高于95%的内切葡聚糖酶蛋白,酶活力可以达到2 245 U/m L。     

基因共表达对人源LysoPLD异源可溶性表达、纯化及酶学性质的影响

目的:为实现人源溶血磷脂酶D（LysoPLD）的原核异源可溶性表达。方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列（GenBank: L46720.1）。采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签（MBP）和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Trigger factor（tig）两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱（Amylose Resin）纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质。结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD和BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD。BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）低温诱导过夜可获得上清表达的MBP-LysoPLD蛋白;BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD在含有0.5 μg/mL L-Arabinose的LB培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80%。以对羟基棕榈酸酯为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致。结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同。