响应面试验优化绿豆凝集素提取工艺

凝血法检测绿豆凝集素活性,并改进凝集活性检测兔血红细胞处理条件,在单因素试验的基础上设计响应面Box-Behnken试验,优化绿豆凝集素提取工艺条件。结果表明,凝集活性检测兔血红细胞的处理最佳条件为戊二醛体积分数0.15%、25 ℃处理血细胞20 min;胰蛋白酶添加量25 U/mL、25 ℃处理15 min,优化条件下提高了兔血红细胞凝集灵敏度且延长了兔血红细胞保存时间。磷酸盐缓冲溶液为绿豆凝集素最佳浸提溶液,绿豆凝集素优化工艺条件为料液比1∶9.09（g/mL）、NaCl浓度0.3 mol/L、浸提时间4.16 h,在此条件下最大绿豆凝集素比活力预测和验证值分别为134.91 U/mg和139.02 U/mg。     

两种来源于牛皮胶原蛋白的新型ACE抑制肽

从牛皮胶原蛋白中鉴定分离出抑制血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)的多肽片段。首先优化牛皮胶原蛋白水解方法,应用胃蛋白酶和碱性蛋白酶获得活性最高的水解产物(抑制ACE的IC50为0.168 mg/m L)。经MW 5000超滤分离后,得到水解液中活性最高的部分(IC50为0.079 mg/m L)。对分离后低于MW 5000的部分经RP-HPLC进一步分离,发现含有大量ACE抑制肽,并应用RP-HPLC-MS/MS鉴定出两种新型ACE抑制肽,氨基酸序列分别为ISVPGPM和LGPVGNPGPA,IC50值分别为0.017 mg/m L(24.3μmol/L)和0.077 mg/m L(87.8μmol/L)。最后,本文模拟了两种抑制肽在体内生理环境下的消化,发现均可被部分降解,且消化产物具有与原始多肽相近的ACE抑制活性。     

不同溶剂对香芋蛋白提取及活性的影响

对张溪香芋的水提物、盐提物、醇提物、Tris提取物、等电点沉淀物的蛋白质、氨基酸组成、总糖含量、总酚含量和包括抗氧化活性、凝血活性及胰蛋白酶抑制活性进行分析,以获得香芋蛋白活性较高的提取物。抗氧化性实验表明,各提取物具有一定的ABTS清除能力和羟基自由基清除能力,其中Tris提取物的ABTS清除能力(IC50=3.78 mg/m L)和羟基自由基清除能力均较高。香芋提取物均对羊血红细胞没有凝血活性,但均对兔血红细胞具有凝集活性,特异性凝集活力大小为盐提物(3.24×103 HU/mg)Tris提取物(2.88×103 HU/mg)等电点沉淀物(1.86×103 HU/mg)水提物(1.41×103 HU/mg)醇提物(0.98×103 HU/mg);五种提取物中,乙醇提取物没有胰蛋白酶抑制活性,盐提物、水提物、Tris提取物胰蛋白酶抑制活性较高,分别为134 TIU/mg、130.51 TIU/mg、113.30 TIU/mg。结果表明,Tris提取物含有较多具有高活性的蛋白质,且蛋白条带较最全。     

猪血红蛋白ACE抑制肽的分离和理化性质研究

以猪血红蛋白的胃蛋白酶水解液为原料,依次通过大孔吸附树脂DA201-C、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进行纯化,最终得到了3个降血压组分;并收集ACE抑制活性最高的组分α-Ⅱ,对其进行理化性质的研究.结果表明,酶解液经过大孔树脂DA201-C脱盐后,IC50为0.87mg/mL;继续经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20分离得到的猪血红蛋白ACE抑制肽(α-Ⅱ)的IC50为0.21mg/mL.分离后的猪血红蛋白ACE抑制肽(α-Ⅱ)在pH为7时,溶解度最低,为50.37％;胃蛋白酶对其活性影响不显著.温度在25～55℃之间以及中性和偏酸性的条件下时,α-Ⅱ具有较好的热稳定性;当NaC1浓度大于0.6mol/L时,其活性急剧下降.     

糖基化大豆蛋白体外消化产物的生物活性研究

为了分析体外消化作用及超滤处理对糖基化大豆蛋白抗氧化活性及抑菌活性的影响,分别利用胃蛋白酶及胰蛋白酶酶解糖基化大豆蛋白,在一定的条件下水解度分别达到了4.9%和6.4%,此时可溶性蛋白质含量分别为13.6、15.0 mg/m L;再经过超滤处理得到相对分子质量低于5 000的组分,两种超滤组分的可溶性蛋白质含量分别为9.65、10.65 mg/m L。糖基化大豆蛋白体外消化产物的抑菌活性没有发生显著变化,但是抗氧化活性下降;进一步的超滤处理能够获得具有较高生物活性的组分:胃蛋白酶消化产物超滤组分的亚铁离子螯合率提高了约1倍;胰蛋白酶消化产物超滤组分的还原力及羟基自由基清除率显著提高;同时,胃蛋白酶消化产物超滤组分对大肠杆菌具有抑制活性,而胰蛋白酶消化产物超滤组分则具有较强的抑制作用。结果表明,结合体外消化作用及超滤处理能够显著改善糖基化大豆蛋白的生物活性。     

酪蛋白类蛋白物的溶剂分级和酶水解对ACE抑制活性的影响

利用响应面法优化类蛋白反应条件修饰酪蛋白水解物制备酪蛋白类蛋白物.酪蛋白类蛋白物的ACE抑制活性高于酪蛋白水解物,IC50值从52.6 mg/L降低到14.9 mg/L.利用乙醇-水混合溶剂对酪蛋白水解物和类蛋白物进行分级,结果表明,极性最低的溶剂得到的上清液部分活性较高,而沉淀部分活性较低.4种蛋白酶水解酪蛋白类蛋白物的分级产物,导致活性下降,除碱性蛋白酶外,木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解产物ACE抑制活性为31.5％～46.8％,但是仍然高于酪蛋白水解物的ACE抑制活性(27.8％),表明类蛋白反应提高了酪蛋白水解物对一些蛋白酶的体外抵抗能力.     

鱿鱼肝脏蛋白水解液及ACE 抑制肽的制备

为高效利用鱿鱼及其下脚料肝脏蛋白水解物,采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽进行研究。结果表明：胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE 抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件：在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物质量分数2.5%。经过上述条件处理的水解液再经超滤处理(截留分子质量为20kD)后,用Sephadex G-50 进行分离,洗脱得到5 个峰,其中组分B 的ACE 抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。     

罗非鱼鳞明胶的制备及其酶解产物活性研究

以罗非鱼鱼鳞为原料,通过热水提取鱼鳞中的明胶,利用多种蛋白酶对明胶进行酶解,测定其不同酶解产物的抗氧化性、血管紧张素I转换酶(ACE)抑制活性、α-葡萄糖苷酶(AG)抑制活性等生物活性。实验结果表明:100℃热水或120℃热水提取明胶1.5h的得率分别为20.2%和37.9%。6种蛋白酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)水解明胶后,胰蛋白酶水解液和碱性蛋白酶水解液的羟自由基清除力为76.7%和76%,高于Vc的65.6%;除中性蛋白酶对DPPH自由基没有清除力以外,其余5种蛋白酶均对DPPH自由基有清除力,但是低于Vc;胃蛋白酶水解液对α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用最强,为67.1%,而中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解液对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用。6种蛋白酶的水解产物均有的ACE抑制活性,没有抗凝血活性。     

鱼鳞明胶ACE抑制肽的制备及其活性研究

利用Alcalase 2.4L酶解鱼鳞明胶制备具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的降血压肽,通过超滤处理富集得到具有较高活性的ACE抑制肽,并对该组分进行分子量分布、氨基酸组成分析及抗消化性研究。结果表明:水解明胶6 h所得水解物的ACE抑制活性最高,其IC50为0.56 mg/mL,水解度为15.54%;超滤膜处理分离后,分子量小于5 kDa的多肽组分Ⅱ的ACE抑制活性最高,其回收率达90%以上;多肽中对ACE抑制活性贡献大的脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸等疏水性氨基酸的保存率高;体外消化实验显示,该抑制肽在胃肠道消化酶作用下能保持较好的ACE抑制活性。     

鱿鱼下脚料水解物的制备及降血压抑制肽研究

通过对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽的研究,为鱿鱼及其下脚料水解物的高效利用奠定了理论基础。采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术进行研究。实验得出:胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件:在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物浓度2.5%。经过上述条件处理后的水解液经超滤处理(分子量为20ku)后,用Sephadex G-50进行分离,洗脱得到等5个峰值,其中组分B的ACE抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。     

体外模拟消化对大米谷蛋白结构及水解产物生物活性的影响

通过体外模拟消化,研究不同消化时间下谷蛋白结构与抗氧化和血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性的关系。利用内源荧光光谱和傅里叶变换红光谱测定谷蛋白水解过程结构变化。通过测定水解产物抗氧化能力和ACE抑制率表征酶解产物的活性,利用四极杆串联飞行时间质谱鉴定具有抗氧化和ACE抑制活性的组分。结果表明,谷蛋白水解度在2 h内快速增加,随后趋于平缓。水解导致谷蛋白λmax红移且荧光强度增强,α-螺旋含量显著增加、β-折叠相对含量显著降低（P＜0.05）。α-螺旋结构含量的增加降低了水解物的抗氧化能力,谷蛋白β-折叠结构含量的减少能增强水解物的ACE抑制能力。水解0.5 h抗氧化能力最强,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）为（1.113±0.015）mg/mL,·OH清除率IC50为（0.518±0.053）mg/mL、Fe2＋螯合能力IC50为（0.678±0.019）mg/mL。ACE抑制率先增加后降低,在2 h达到最高,IC50为（0.693±0.011）mg/mL。水解度的增加降低了水解物抗氧化能力,但增强了ACE抑制能力。水解物在0.5～2 h抗氧化能力和ACE抑制能力呈现负相关关系,随后抗氧化能力和ACE抑制能力均下降。水解物抗氧化肽和ACE抑制肽分子质量均小于2 kDa,筛选出以VEGGFLFIV为代表抗氧化活性多肽,且ACE抑制肽大部分N-端是疏水性氨基酸或者碱性氨基酸。因此,通过控制谷蛋白体外消化水解度,可制备最优的大米谷蛋白抗氧化或降血压相关功能性产品。     

油菜蜂花粉ACE抑制活性酶解物的制备及分离

采用4 种蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白制备ACE 抑制活性物质,高效液相色谱法测定油菜蜂花粉蛋白水解物对ACE 的抑制率。结果表明：油菜蜂花粉蛋白酶水解物具有ACE 抑制活性,水解物对ACE 的抑制活性差异显著(P ＜ 0.05),其中碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶,碱性蛋白酶水解物的IC50 为0.35mg/mL。4 种蛋白酶水解物经Bio P-2 凝胶分离后,ACE 抑制活性较强的组分主要集中在保留时间70～120min,在此区间碱性蛋白酶水解物分离组分对ACE 的抑制率达到90% 以上,分子质量在376.4～1355D 之间。     

King Boletus mushroom-derived bioactive protein hydrolysate: characterisation,antioxidant, ACE inhibitory and cytotoxic activities

The enzymatic-bromelain King Boletus mushroom protein hydrolysate (eb-KBM) was determined in terms of the biological properties (antioxidant, antihypertensive and cytotoxic activities) and compared with unhydrolysed or water-soluble King Boletus mushroom extract (ws-KBM). The eb-KBM showed high antioxidant activities, as assessed by ABTS (70.9%), DPPH (60.9%) assays and hydroxyl radicals (66.0%) scavenging method. Angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory activity of eb-KBM was 21.1% at 1 mg protein mL⁻¹. Anticancer activity-relevant cytotoxicity of eb-KBM in ChaGo-K1 (undifferentiated lung carcinoma) and HEP-G2 (hepatocarcinoma) cells was higher than that of ws-KBM, with lower IC₅₀ values (6.43 and 6.35 µg mL⁻¹, respectively). The great biological activities of eb-KBM were related to its amino acid composition, with high contents of hydrophobic amino acids and aromatic amino acids. These results indicate that King Boletus mushroom protein hydrolysate or bioactive peptide could be used as natural antioxidative, ACE inhibitory and anticancer activities in the nutraceutical and pharmaceutical industries.     

南瓜籽蛋白源血管紧张素转化酶抑制肽的制备及其降血压活性

食源性降血压肽在调节机体血压过程中发挥着一定的积极作用。本实验采用碱性蛋白酶水解南瓜籽蛋白,水解物经膜分离获得血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽,通过质谱鉴定其结构,并采用抑制动力学和分子对接方法研究ACE抑制肽的活性机制;此外,通过ACE抑制活性实验、自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHRs）模型等评价南瓜籽蛋白水解物、膜分离组分以及南瓜籽肽的降血压活性。结果表明,低于1 kDa南瓜籽蛋白水解物组分ACE抑制活性较好,1 mg/mL下ACE抑制率为46.22%,100 mg/kg mb 剂量下灌胃SHRs 6 h后收缩压可以降低21.42 mm Hg;鉴定出9 个ACE抑制肽（LLV、LVF、LTPL、SVLF、LLPQ、MLPL、LLPGF、VLLPE和RFPLL）,其中RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有较好的ACE抑制活性,半抑制浓度均低于1 mmol/L;RFPLL和LVF具有较好的降血压活性,30 mg/kg mb剂量下灌胃6 h后SHRs的收缩压降低量分别为37.0 mm Hg和22.2 mm Hg,SHRs的舒张压降低量分别为17.0 mm Hg和11.2 mm Hg;RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地对接ACE的活性中心,RFPLL是ACE混合型抑制剂,MLPL对ACE的抑制模式可能是竞争型抑制,LLPGF、LVF可能是ACE的非竞争型抑制剂。综上,低于1 kDa南瓜籽蛋白水解物是一种良好的降血压功能食品原料,其中RFPLL和LVF可用于降血压功能食品或者药品的开发原料。     

高血管紧张素转化酶抑制活性燕麦蛋白酶解物的精制

先后采用离子交换和超滤工艺对高血管紧张素转化酶(Angiotensin I Converting Enzyme,ACE)抑制活性的燕麦蛋白酶解物进行了脱盐和富集2步精制处理。结果表明,在洗脱流速8倍柱体积/h和洗脱温度15℃条件下,离子交换处理能脱除酶解物中85.7%的盐分;超滤(截留相对分子质量为10000)富集可将酶解物的ACE抑制活性提高37%。精制后的酶解物中灰分含量为1.4%,蛋白质含量为90.3%,IC50值为0.135mg/mL。     

马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选

为探索马氏珍珠贝肉的水解规律及快速鉴定血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性肽,本研究以不同时间（2、4、6、8、10 h）的酶解物为对象,采用三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子质量分布、反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）表征其水解规律。另外,对10 h酶解物进行初步分离纯化,鉴定高活性组分中的肽序列,并采用分子对接的方法对鉴定的肽进行筛选,验证筛选肽的活性,阐释其抑制机理。结果表明,马氏珍珠贝肉在酶解过程中,大分子质量蛋白逐渐水解为小分子肽,在RP-HPLC上出现某一特征峰的富集。初步分离后,发现F2、F3组分具有较高的ACE抑制活性,从这2 个组分中共获得了可信度较高的54 个肽序列。分子对接筛选出6 个潜在的ACE抑制肽,在1 mg/mL时,5 个肽具有不同程度的ACE抑制活性,其中,WFHAVFW和WHAFLW显示了最高的ACE抑制活性,分别为（95.57±0.37）%和（98.59±0.08）%,进一步测定六肽WHAFLW的半抑制浓度（IC50）值,为52.39 μmol/L。分子对接显示肽的抑制机理可能是通过氢键、范德华作用以及Pi-Pi作用形成稳定的肽-酶复合物。本研究既揭示了珍珠贝肉蛋白不同酶解时间的规律变化,又将活性实验跟踪与计算机辅助筛选相结合,提供了一种快速筛选酶解物中高活性ACE抑制肽的方法。     

基于超声预处理的脱脂玉米胚芽ACE抑制肽的制备

为了研究超声辅助酶解制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的较优工艺,通过三种超声设备对脱脂玉米胚芽预处理,碱性蛋白酶酶解,酶解液体外模拟胃肠消化,以消化液ACE抑制率和酶解过程中玉米胚芽水解度(DH)为指标对超声预处理和酶解的参数进行单因素逐级优化。实验结果表明,最佳超声工作模式为20~40 kHz聚能式逆流双频交替超声模式;超声工作参数为功率密度120 W/L,超声预处理时间15 min,初始温度30℃,物料浓度5%;酶解条件为加酶量3000 U/g,酶解时间30 min,pH9.0,酶解温度50℃。在此条件下,酶解液的IC₅₀为4.166 mg/mL,比对照组降低了5.08%;胃肠消化液的IC₅₀为3.986 mg/mL,比对照降低了4.44%。制备的酶解产物,经模拟胃肠消化后具有较强的ACE抑制活性。优化获得的制备脱脂玉米胚芽ACE抑制肽的工艺是可行的。     

Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis

This work reports the antioxidant activity of peptides produced by enzymatic hydrolysis of crude egg white with pepsin. Four peptides included in the protein sequence of ovalbumin possessed radical scavenging activity higher than that of Trolox. The hydrolysate of egg white with pepsin for 3 h was previously found to exhibit a strong angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity in vitro. The combined antioxidant and ACE inhibition properties make it a very useful multifunctional preparation for the control of cardiovascular diseases, particularly hypertension. No correlation was found between antioxidant and ACE inhibitory activities. However, the peptide Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu, which was a strong ACE inhibitor (50% inhibitory concentration, 4.7 microM) also exhibited a high radical scavenging activity (oxygen radical absorbance capacity-fluorescein value, 3.8 micromol of Trolox equivalent per micromol of peptide) and delayed the low-density lipoprotein lipid oxidation induced by Cu2+ at a concentration of approximately 0.16 mg/mg of low-density lipoprotein. Present results support that antioxidant peptides and amino acids not only act individually, but also cooperatively and synergistically.     

HPLC-ESI-MS对珠蛋白酶解液中的血管紧张素I转换酶抑制肽的分离鉴定

本实验利用ESI-MS/MS对反相高效液相色谱分离的具有血管紧张素I转换酶(ACE)抑制活性的珠蛋白小肽的结构进行鉴定。结果表明:此肽的序列为Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr(VVYPWT),位于猪的血红蛋白β链的34-39氨基酸序列片断,它对ACE有很好的抑制活性,其IC50为6.02μmol/L。     

马氏珠母贝肉酶解产物ACE抑制活性的研究

利用胰酶、枯草杆菌中性蛋白酶,在50℃、pH为7.0～8.0,m(贝肉)∶V水=1∶3的条件下,对马氏珠母贝肉进行双酶水解4h制备得到酶解产物及残渣。利用Alcalase2.4L、胃蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶对残渣进行再次酶解。结果表明:残渣蛋白质含量按干基计达54.2%;Alcalase 2.4L、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶对残渣的酶解效果较好;残渣的木瓜蛋白酶酶解产物ACE抑制活性较强;马氏珠母贝肉酶解产物清除自由基活性较强的组分分子量为944u,残渣木瓜蛋白酶酶解产物清除自由基活性较强的组分分子质量在1300～259u。