一株血红栓菌的分离鉴定及其产漆酶发酵条件与脱色研究

本研究从杭州西溪湿地采集到一株白腐真菌的子实体,并分离其菌丝,编号为H-1。结合形态学特征、ITS序列分析和进化树分析,菌株H-1与Trametes sanguinea的同源性最高,鉴定为血红栓菌Trametes sanguinea H-1。进一步研究在液态发酵条件下碳源、氮源、诱导剂和摇瓶装液量对T. sanguinea H-1胞外漆酶产量的影响,结果表明,以小麦淀粉为碳源,酒石酸铵为氮源,硫酸铜为诱导剂,250 mL的摇瓶装液量为100 mL,血红栓菌H-1产漆酶的酶活力最高,其酶活力达到3527.8 U/L。native-PAGE分析,其漆酶可能大小约为45 kDa的单一蛋白。血红栓菌H-1漆酶对刚果红脱色率达到65.4%,对孔雀石绿脱色率达到47.5%,对亚甲基蓝的脱色率达到31.3%。本研究可为血红栓菌H-1在染料废水脱色的应用奠定基础。     

几种产木素降解酶白腐菌对碱木素的降解研究

白腐菌分泌胞外氧化酶——木素降解酶。这类氧化酶底物专一性不强，除降解木素外还降解大量的污染物。首先观察4种白腐菌Pleurotus eryngii,Polyporus versicolor，Pleurotus ostreatus和Fomes lignosus在限氮和富氮培养基中产木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的能力，4种真菌只产锰过氧化物酶和漆酶。由于Pleurotus eryngii喇和Pleurotus eryngii产酶能力较强，用于碱木素的降解脱色，二者在限氮条件下11天对碱木素降解脱色率为65％和72％。0．6g／L Ca^2 有助于菌体生物量的增加，对产酶影响不明显；10mg／L Mn^2 有助于锰过氧化物酶活性的提高：5mg／L Cu^2 可显著提高菌体产漆酶能力，10天可使碱木素的降解脱色率达到90％。     

杏鲍菇菌渣产漆酶及其在染料脱色中的应用

以杏鲍菇菌渣为原料,探讨了其固态发酵产漆酶的条件,并对粗酶液在染料脱色中的应用进行了初步探索。结果表明,当添加质量分数4%甘蔗渣、质量分数1.2%硝酸铵、质量分数1.0%碱木素时,杏鲍菇菌渣产酶能力最强,达到386.9 U/gds。相对于杏鲍菇菌渣初始漆酶酶活18.6 U/gds,优化后提高了20倍以上。最适条件下,发酵粗酶液在无介体存在下对甲基红、活性艳蓝K3R、酸性蓝209、活性艳蓝KNR的脱色率分别达到85.8%、85.6%、68.3%、71.2%,在添加介体的条件下活性艳蓝K3R、酸性蓝209、活性艳蓝KNR的脱色率分别达到88.8%、93.4%、89.7%。显示出杏鲍菇菌渣漆酶良好的环保应用前景。     

一株产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件优化研究

针对已筛选出的一株能生产几丁质脱乙酰酶(CDA)的海洋丝状真菌,考察其最佳发酵培养基和发酵条件。通过单因素与正交实验得出该菌的最佳产酶条件为:初始p H为6.0,发酵温度为30℃,发酵时间为108 h,葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L,Na Cl浓度为1.4%。通过酶活的测定,发现该丝状真菌合成的几丁质脱乙酰酶主要是胞外酶。在最佳发酵条件下该丝状真菌的最高CDA胞外酶活为21.37 U/m L。是一株具有开发潜力的几丁质脱乙酰酶生产菌株。     

重组角质酶的制备及合成乙酸乙酯条件优化

为了实现镰孢菌角质酶的高效表达,对重组菌株P. pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度28℃,初始诱导菌浓OD600为100,诱导阶段甲醇体积分数为1%条件下进行诱导产酶。在该条件下发酵138 h时上清酶活可达到最大值419 U/mL,是优化前的2倍。对重组角质酶在有机溶剂中合成乙酸乙酯的酯化条件进行了优化,结果表明,当底物乙酸浓度为0.1 mol/L,乙醇浓度为0.15 mol/L,温度50℃,在异辛烷中反应16 h,乙酸乙酯可以达到最大转化率94.12%。     

重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶(PAL)发酵条件研究

本文对重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶的发酵条件和补料培养工艺进行了研究。摇瓶培养条件下,重组菌生长和产酶的最适初糖浓度为10g/L,酵母膏的最适添加量为5g/L,培养基最适初始pH值为7.5。采用10L发酵罐对该菌进行指数流加培养,24 h细胞干重达到到82.4 g/L,产酶量达到3477U/L,比摇瓶培养最好结果分别提高了14.2和11.2倍。     

降解铬革屑微生物发酵条件的优化研究

对一株能粗降解铬革屑菌株的发酵条件进行优化,通过Folin试剂法测定了不同发酵条件下发酵液的蛋白酶活性,确定了菌株W_(1-1)的最适产酶条件。研究表明:菌株的最适产酶条件为葡萄糖9.0%,酵母膏0.5%,CaCl_20.3%,K_2HPO_40.3%,MgSO_4 0.2%,初始pH 8.5,装液量90mL(90/250mL三角瓶),接种量4.0%,种龄14h,发酵温度37℃,发酵时间36h。在此条件下,测得发酵液的蛋白酶活力为37.36u/mL,比优化前的产酶量提高了35.4%;最后,采用该菌株在最适产酶条件下对铬革屑进行降解,降解率达到71.38%。     

双偶氮染料的茶渣固态漆酶脱色

利用变色栓菌茶渣固态发酵制备的茶渣固态漆酶对双偶氮类染料进行脱色,并以直接耐晒黄RS为代表,研究其脱色机制和脱色效果。结果表明,在茶渣固态漆酶用量为160 U/L、染料质量浓度为100 mg/L条件下反应2 h后,直接耐晒黄RS的脱色率达到81.10%。研究发现,茶渣固态漆酶的脱色机制包括游离漆酶降解、茶渣吸附和固定化漆酶降解三部分,对直接耐晒黄RS的脱色率分别为16.40%、43.20%和19.70%。茶渣固态漆酶在染料脱色中表现出较好的重复使用性能,重复利用4次,脱色率仍保持在50%以上。毒性检测结果表明,绿豆种子的萌发率从36.67%提高到85%,脱色后染料溶液毒性明显下降。利用茶渣固态漆酶对染料脱色具有时间短、效率高、可重复利用和成本低等优势,在染料脱色方面具有良好的前景。     

高产L-乳酸干酪乳杆菌的选育及发酵条件研究

以一株产L-乳酸的干酪乳杆菌G-02为出发菌,采用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)进行诱变,利用高温高糖培养基选育出一株L-乳酸发酵活力较强的菌株G-04。并且对该株菌7L发酵罐发酵条件进行了研究,探讨了溶氧、中和剂、补料方式对发酵过程的影响。实验结果表明:在适当的发酵条件下,该菌株可积累L-乳酸浓度达到188g/L,糖转化率大于90%,发酵周期小于44h。     

酶法降解甘蔗渣木质素的条件研究

研究木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶降解蔗渣中木质素的酶解作用条件,得到优化后的酶解木质素条件:酶解液最适pH值为4.0、温度为40℃、酶解时间48h,酶解液中木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶活力分别为1.26、1.45、2U/mL,葡萄糖和乙酰丙酮浓度分别为0.01mol/L和0.05mol/L,此时木质素的降解率为18.46%,提高纤维素酶水解率28.67%。     

不同碳源对Klebsiella pneumoniae WA-1孔雀石绿脱色和降解的影响

利用变色圈法从孔雀石绿污染的养殖池塘中筛选到1 株具有较强孔雀石绿脱色和降解能力的细菌，经过16S rDNA基因序列比对及系统进化树分析，结合VITEK 2微生物鉴定系统，鉴定该菌为Klebsiella pneumoniae，重命名为K. pneumoniae WA-1。采用分光光度法和硼氢化钾还原-高效液相色谱法研究不同碳源对孔雀石绿脱色和降解的影响，发现菌株在盐培养基中表现出很强的孔雀石绿脱色和降解能力，添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源时孔雀石绿（5～40?mg/L）的脱色率有所提高，均接近100%，但是孔雀石绿（5?mg/L）降解率显著降低。明确了孔雀石绿首先在细胞外由孔雀石绿还原酶还原成隐性孔雀石绿，然后通过主动运输进入到细胞被进一步降解的脱色和降解过程，并揭示了不同碳源对菌株孔雀石绿脱色和降解的影响机制。本研究为K. pneumoniae WA-1的孔雀石绿降解机制研究提供重要思路，也为后期孔雀石绿降解的应用提供重要理论基础。     

养殖水中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量的测定

目的建立一种高效液相色谱-串联质谱同时测定养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物和亚甲基蓝残留量的方法。方法将水样用盐酸羟胺-对甲苯磺酸溶液和乙腈提取,二氯甲烷萃取2次后浓缩,用1 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵(1:1,V:V)定容。以乙腈-5 mmol/L乙酸铵(85:15,V:V)混合溶液为流动相进行色谱分离,然后进入串联质谱仪,选用电喷雾离子源,在正离子、多反应监测扫描模式下进行定性,孔雀石绿和结晶紫通过内标法定量,亚甲基蓝通过外标法定量。结果在优化条件下,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫在0.025~0.600 ng/mL浓度范围内,亚甲基蓝在0.05~1 ng/mL浓度范围内均满足线性关系,相关系数r0.99,方法检出限为0.2 ng/mL。加标浓度在0.2~2.0 ng/mL时,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫和亚甲基蓝的平均回收率均在70%~110%之间,相对标准偏差均在10%以内。结论该方法简单快速、灵敏度高、前处理成本低、重现性好、回收率高,适用于同时检测养殖水体中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量。     

一色齿毛菌对直接大红4BS染料的脱色

为避免染料废水处理造成二次污染,采用生物法对直接染料进行脱色处理,通过观察接种一色齿毛菌后染料固体培养基颜色的变化,评价一色齿毛菌对5种直接染料的脱色效果;利用单因素和正交试验对一色齿毛菌脱色直接大红4BS的条件进行优化,得到优化条件:葡萄糖质量浓度为20 g/L,硝酸铵质量浓度为1 g/L,硫酸镁浓度为1.5 mmol/L,每50 mL反应体系接菌量为2片(直径为1 cm)。结果表明:一色齿毛菌对5种直接染料均有脱色能力,其中对直接大红4BS染料的脱色更为彻底;在优化条件下,一色齿毛菌对直接大红4BS脱色13 d时的脱色率达92.00%, 与优化前的脱色率相比提高了50.82%。     

水中孔雀石绿、结晶紫残留量的同时测定

建立固相萃取-高效液相色谱法测定水中孔雀石绿、结晶紫的残留量。以硼氢化钾溶液将孔雀石绿、结晶紫还原为隐色孔雀石绿、隐色结晶紫,乙腈/二氯甲烷提取残留物,提取液依次通过酸性氧化铝柱/PRS柱净化、洗脱。结果表明:该方法能很好的除去水中的干扰物,方法回收率在84%～93%,隐色孔雀石绿的最低检出限为0.96μg/L,隐色结晶紫的最低检出限为1.02μg/L,适合于水中孔雀石绿、结晶紫的分析测定,具有良好的实验室应用前景。     

深圳市淡水鱼类中孔雀石绿及结晶紫残留状况的调查分析

目的调查分析深圳市市售水产品鱼类中孔雀石绿及其代谢物、结晶紫及其代谢物的残留情况。方法样品依据GB/T 19857-2005经超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法(ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定样品中的孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫。结果 300份鱼类样品孔雀石绿及其代谢物的检出率为1.67%(5/300)、结晶紫及其代谢物的检出率为23.67%(71/300);500份鱼养殖水样品中结晶紫及其代谢物的检出率为0.6%(3/500),孔雀石绿及其代谢物无检出。不同种类养殖鱼间比较,鲈鱼、生鱼、黄骨鱼的检出率均在36%以上。结论深圳市在售鱼类中存在孔雀石绿/结晶紫及其代谢物检出率高而暂养水检出率低的情况,因此鱼类运输、批发零售环节添加孔雀石绿/结晶紫的可能性较小,养殖环节的滥用值得关注。     

液相色谱紫外／荧光检测法测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿

试验旨在建立一种检测水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的液相色谱-紫外/荧光检测方法,并对样品前处理方法进行简化。在乙腈作为溶剂提取步骤中同时加入酸性氧化铝吸附,提取液离心分离后采用串联的丙磺酸阳离子固相萃取柱(PRS)和酸性氧化铝柱净化,0.05 mol/L的乙酸铵/乙腈(20∶80,V/V)为流动相,采用液相色谱-紫外/荧光检测法同时分析孔雀石绿和隐性孔雀石绿的含量,外标法定量。结果表明:孔雀石绿和隐性孔雀石绿在0.05~1.0 mg/L范围内线性良好,相关系数分别为为0.9999和0.9996,最低检出限分别为0.002 mg/L和0.5μg/L。当加标量分别为10、25、50μg时,空白鱼样的加标回收率在72.0%~91.4%之间,RSD均小于7.5%。该方法准确度高,适于水产品中孔雀石绿及其代谢残留产物—隐性孔雀石绿的分析检测。     

高分子印记固相萃取-液相色谱质谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫、亮绿及其代谢产物

目的建立一种高分子印记固相萃取-液相色谱质谱联用(MISPE-HPLC/MS2)测定水产品中孔雀石绿、结晶紫、亮绿及其代谢产物的检测方法。方法样品经乙腈提取后,经中性氧化铝柱和高分子印记固相萃取柱净化,Waters Atlantis T3色谱柱(2.1 mm×150 mm,3μm)分离,乙腈和0.1%甲酸水等度洗脱,采用选择反应监测(SRM)模式进行正离子扫描,内标法定量。结果待测化合物在0.2～10μg/L范围内有很好的相关性,相关系数大于0.99,加标水平为1、2、4μg/kg,孔雀石绿、结晶紫和亮绿的平均回收率分别为93.2%～105.9%、92.7%～107.5%和60.6%～94.4%,相对标准偏差均小于12.5%,孔雀石绿、结晶紫和亮绿的检出限分别为0.02、0.03、0.03μg/kg,定量限分别为0.07、0.10、0.10μg/kg。结论本方法前处理净化效果更好、灵敏度更高,同时采用稳定性同位素稀释技术及基质匹配标准曲线,将基质抑制效应降低到最低,适用于大批量鱼类产品中孔雀石绿、结晶紫和亮绿的检测。     

广东省市售鳜和鲩体内孔雀石绿与硝基呋喃类 及其代谢物残留现状研究

目的 研究广东省市售鳜和鲩体内孔雀石绿(MG)与硝基呋喃类(NFs)及其代谢物残留现状。方法 111份鳜和鲩样品分别购自广州、深圳、佛山、中山、汕头和茂名等地,采用高效液相色谱串联质谱法检测孔雀石绿与硝基呋喃类及其代谢物。结果 孔雀石绿及其代谢物检出率和硝基呋喃类代谢物检出率分别为33%和14%;孔雀石绿残留主要是隐色孔雀石绿,硝基呋喃类残留主要为氨基脲和3-氨基-2-恶唑烷酮;中山鳜鱼中孔雀石绿和氨基脲检出率最高,分别为83%和50%,佛山鲩体内隐色孔雀石绿检出率为20%;批发市场鳜中孔雀石绿检出率为38%,零售市场高达71%。结论 孔雀石绿及其代谢物检出率高于硝基呋喃类代谢物检出率。孔雀石绿残留主要以其代谢物隐色孔雀石绿形式存在,四种硝基呋喃药物中呋喃唑酮和呋喃西林使用更为普遍。中山和佛山是传统的水产养殖发达地区,孔雀石绿和硝基呋喃类代谢物残留水平相对其他采样点更加严重。与批发市场相比,零售市场鳜鱼孔雀石绿残留检出率更高,应当重点关注。     

基于质量评价的孔雀石绿快检试剂盒筛选策略

目的建立快速筛选出技术指标合格的市售水产品孔雀石绿残留快速检测试剂盒的方法。方法选用5种市售孔雀石绿快检试剂盒比较其操作步骤、检测时间、提取效率,同时参考SN/T 2775-2011和GB/T19857-2005进行灵敏度、特异性、假阴性率与假阳性率等技术指标测试,提出基于质量评价的试剂盒快速筛选策略。结果 5个品牌的孔雀石绿检测试剂盒质量参差不齐,品牌A、B与C的灵敏度99%,特异性≥85%、假阴性率 1%,假阳性率≤15%,不符合试剂盒评价标准;品牌D与品牌E的灵敏度≥99%、特异性≥85%、假阴性率≤1%,假阳性率≤15%,符合试剂盒评价标准。结论对市场销售的水产品中孔雀石绿残留检测试剂盒要进行采购前、采购中的质量评价,在评价时综合考虑操作步骤的简便性、时效性、评价批次、样品来源等,同时兼顾灵敏度、特异性、假阴性率与假阳性率技术指标,快速筛选出符合标准的试剂盒。