普通烟草PPO基因家族的鉴定与表达分析

为探明烟草多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)基因家族的生物学功能,对普通烟草PPO基因家族进行了鉴定和分析。结果表明,普通烟草有10个Nt PPOs基因,基因结构简单,蛋白结构高度保守。7个Nt PPOs基因分别定位在第3、4、5和20号染色体上,另外3个Nt PPOs基因无具体定位信息。Nt PPOs蛋白与番茄、马铃薯的亲缘关系较近。q RT-PCR结果表明,8个Nt PPOs基因在幼蕾、花瓣和蒴果中高量表达,在根、茎、叶中表达量较低;Nt PPO7与Nt PPO8在根中表达量较高,表明Nt PPOs在进化过程中出现了功能分化。     

烟草酪氨酸转氨酶基因家族分析

为揭示烟草酪氨酸转氨酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)基因家族的遗传特征和功能,利用生物信息学对不同烟草品种中该基因家族进行鉴定和分析。结果表明,普通烟草中存在4个TATs基因,林烟草和绒毛状烟草中各有3个TATs基因。亚家族Ⅰ中TATs基因的编码序列在1 263~1 338 bp,编码404~445个氨基酸,蛋白质分子量为42.81~49.64 k D,均为不含跨膜结构域的稳定蛋白。亚家族Ⅱ中TATs蛋白均为不稳定蛋白。除NtabTAT4外,其余TATs基因均含有7个外显子和6个内含子。烟草TATs蛋白可分为两类:Group Ⅰ和Group Ⅱ。qPCR分析表明,NtabTATs在普通烟草K326的根、茎、叶和花中都有表达。     

烟草HD-ZIP Ⅳ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析

为了明确NtPDF2在烟草中的生物学功能及其调控腺毛分化发育的作用机制,同源克隆了烟草NtPDF2基因,并对其序列、基因结构、进化关系以及表达模式进行分析。结果表明:NtPDF2 CDS全长为2 199 bp,编码732个氨基酸残基。烟草PDF2蛋白质序列高度保守,尤其是C端序列,均含有3个保守结构域(Homeobox domain,START domain和SAD domain)和1个保守LZ(Leucine zipper)元件。烟草PDF2基因结构高度保守,均由10个外显子和9个内含子组成。进化分析表明,普通烟草NtPDF2基因是由林烟草ML1基因进化而来。表达分析显示,烟草PDF2基因表达具有明显的时空特异性。干旱、黑暗和磷饥饿胁迫可显著下调NtPDF2基因的表达,而盐胁迫对其没有明显影响;NtPDF2基因的表达在赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)和打顶处理条件下均显著上调,这暗示烟草NtPDF2基因参与了调控多种非生物胁迫和激素应答过程。     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。     

烟草bZIP基因家族的鉴定及其在不同成熟度烟叶中的表达分析

通过生物信息学方法,从普通烟草中共鉴定了126个bZIP家族基因。基因结构分析表明:不同成员间外显子数目差异较大,最大达到13个,最少仅为1个。进化分析发现:126个NtbZIP基因被聚为11个亚族,同一亚族中的基因成员大多具有相似的外显子组成。bZIP结构域分析表明:家族成员的核心结构域非常保守,各成员都具有碱性区和亮氨酸拉链区。烟草与拟南芥bZIP基因系统进化分析显示:11个亚族中均存在烟草和拟南芥的bZIP成员,其中S分支所含的家族成员最多,共有43个成员。NtbZIP基因表达分析发现:大部分NtbZIP基因在不同成熟度烟叶中都有表达,但是不同成员的表达模式存在差异,其中NtbZIP84,NtbZIP115,NtbZIP119和NtbZIP120等基因表达量随成熟度提高而逐渐降低。      

烟草组织蛋白酶B基因的结构特征分析及mRNA表达

为了明确烟草中组织蛋白酶B基因的功能,对烟草组织蛋白酶B基因(NbCathB)进行了序列分析.该基因ORF长951bp,编码316个氨基酸.该基因蛋白质的预测分子量为35.2 kD,等电点为6.14.对NbCathB的基因结构分析显示,该基因具有8个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则.比较NbCathB和AtCathB基因,显示两者编码氨基酸序列一致性为61％.通过SMART软件分析,NbCathB和AtCathB基因的结构域很相似.在上清液、菌体、菌液以及水4种处理烟叶中的表达谱鉴定显示,在喷施MP制剂(巨大芽孢杆菌)菌体和菌液的烟叶中NbCathB的表达量明显高于在喷施MP制剂上清液的烟叶中的表达量,而在喷施水的烟叶中的表达量最低.说明NbCathB很可能发挥了AtCathB相同的作用.     

烟草Nt14-3-3基因的克隆及生物信息学和表达模式分析

为明确烟草中Nt14-3-3基因家族的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个14-3-3蛋白基因Nt14-3-3,并进行了生物信息学分析。运用qRT-PCR技术,对该基因非生物胁迫处理烟草幼苗后的表达特性进行了分析。结果显示,该基因序列全长783 bp,编码260个氨基酸残基。Nt14-3-3蛋白是由9个α螺旋组成的球状蛋白,含有32个磷酸化位点。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。Nt14-3-3基因受低钾、高盐、干旱、脱落酸(ABA)、H_2O_2处理的诱导,表明烟草Nt14-3-3基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17的鉴定及表达特性分析

为研究烟草谷胱甘肽转移酶(GSTs)的功能,采用同源搜索的方法从NCBI数据库中找到1个烟草GSTs类似基因,通过聚类分析、体外活性分析对该基因及其表达产物进行鉴定;打顶和农药(代森锰锌、百草枯)处理烟草后,运用荧光实时定量PCR技术对该基因的表达特性进行分析。结果表明:该基因是tau类GST基因,命名为Nt GSTU17,其编码区长666 bp,编码221个氨基酸;该基因编码产物对谷胱甘肽转移酶通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)具有较高的偶联活性;Nt GSTU17基因在烟草中为组成型表达,但在根中的表达量要低于地上部分的表达量;打顶对该基因的表达有一定上调效应;代森锰锌处理烟草后在短期内能快速、显著上调Nt GSTU17基因的表达,而百草枯处理烟草后则能显著抑制根中Nt GSTU17的表达,表明Nt GSTU17基因可能参与烟草的胁迫应答反应,并对不同农药的胁迫表现出选择性。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。      

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生，为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异，克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列，对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因，NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2），其中ProNtCycB2-1来自于林烟草，ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草，这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件，以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件；（3）以GUS为报告基因，研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现，NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达，其中NtCycB2-1启动...     

两个烟草Nup96基因的分子克隆及其表达分析

为研究烟草低温早花的分子机理,采用RT-PCR结合RACE法,从烟草品种NC82中克隆到2个Nup96基因c DNA全长序列,分别命名为Nt Nup96a和Nt Nup96b,Gen Bank登陆号分别为KU558693和KU558694。序列分析表明2个基因均编码1037个氨基酸残基的蛋白,氨基酸序列一致性为97%,与拟南芥Nup96蛋白(NP_178183)的序列一致性为60%;2个基因编码蛋白具有典型的植物Nup96结构特性,包含1个Nup96结构域和1个自酶解结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常的生长条件下,Nt Nup96a和Nt Nup96b在烟草各组织中均有表达,在叶片中的表达量较弱,且随着植株生长其表达量显著下降;在12℃处理10天后,在烟草叶片中2基因的表达都出现了明显的下调,这一结果提示Nup96可能是烟草开花时间调控的抑制因子,其受低温诱导下调表达可能与NC82低温敏感,易早花特性相关。     

普通烟草KCS基因家族的鉴定及非生物胁迫表达模式分析

【目的】为探究烟草KCS基因在非生物胁迫下所起的作用。【方法】采用生物信息学方法对烟草KCS基因进行系统进化、共线性和表达模式等分析。【结果】从普通烟草中鉴定出41个KCS基因;拟南芥和新鉴定的烟草KCS基因可划分为8个亚组,大部分亚组均含拟南芥和烟草成员;10个NtKCS成员源自全基因组复制事件,NtKCS10和NtKCS11是AtKCS02的同源基因,可能具有相似的生物学功能;普通烟草KCS基因启动子含多个与胁迫相关的顺式作用元件,其成员的表达具有一定的组织特异性;在盐和干旱胁迫下,NtKCS09、NtKCS11和NtKCS16表达量均有提高,可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。【结论】本研究对普通烟草KCS家族成员进行了系统的鉴定与分析,为深入研究烟草KCS家族基因的生物学功能奠定理论基础。     

烟草KNOX基因家族的结构与表达模式分析

KNOX基因家族是具有同源异型盒结构域的转录因子,在植物形态建成、模式形成等过程中起重要调控作用。为明确烟草KNOX基因的结构及生物学功能,分别从普通烟草、林烟草和绒毛状烟草中鉴定出18、8和5个KNOX基因,并对其系统进化、基因结构、蛋白功能域及基因表达模式进行分析。结果表明,烟草KNOX基因可分为NtKNOXⅠ和NtKNOXⅡ两个亚类,两亚类又进一步分为5个进化分支。同一进化分支中烟草KNOX蛋白的功能域以及其编码序列在基因结构上的分布高度保守。基因表达分析表明,普通烟草中NtKNOXⅡ类基因在多个组织中表达,而且整体表达水平高于NtKNOXⅠ类基因。在林烟草和绒毛状烟草的根和叶中表达量最高的KNOX基因不同。     

烟草转录因子MYB12基因克隆及表达模式分析

R2R3-MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育和代谢活动中发挥着重要的调节作用。为明确MYB12转录因子在烟草中的生物学功能和调控机制,同源克隆了普通烟草MYB12基因(NtMYB12a和NtMYB12b),利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析对基因功能和调控机制进行了初步预测。结果表明,NtMYB12a和NtMYB12b核苷酸序列一致性为92.91%,氨基酸序列一致性为87.91%。烟草MYB12基因结构高度保守,均由4个外显子和3个内含子组成。进化分析表明,普通烟草中NtMYB12a系由绒毛状烟草MYB12基因进化而来,而NtMYB12b则来源于林烟草。NtMYB12基因表达具有时空特异性,烟草在打顶以及盐、干旱、黑暗和磷饥饿等胁迫处理后,NtMYB12a和NtMYB12b基因表达差异明显,NtMYB12a基因表达水平在打顶处理下呈现上调趋势,在盐、黑暗和磷饥饿胁迫处理下显著下调,而在干旱胁迫下无明显变化;各种胁迫处理均可诱导NtMYB12b基因表达水平的提高,预示着NtMYB12基因在烟草响应各种非生物胁迫中发挥着重要的调控作用。     

普通烟草碳酸酐酶家族基因的生物信息学分析

为挖掘普通烟草碳酸酐酶基因的信息并探讨其功能,本研究利用生物信息学方法,在烟草基因组数据库中对普通烟草碳酸酐酶家族成员进行了检索,并对其理化性质、遗传进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式作用元件和组织表达模式进行了分析。结果显示,在普通烟草中至少含有9个α和6个β亚家族成员。在进化关系上,不同亚家族成员之间,序列同源性较低;与水稻相比,拟南芥和普通烟草两个亚家族间的亲缘关系较近。亚细胞定位分析结果显示,烟草α亚家族成员在细胞壁、细胞膜、线粒体、叶绿体、细胞质等细胞器中均有分布,而β亚家族成员均存在于叶绿体中。基因结构和保守基序分析说明,各亚家族成员的基因结构和蛋白保守基序呈现较高的一致性。启动子顺式作用元件分析显示,烟草碳酸酐酶基因的启动子中,均含有多个参与光反应、激素响应、非生物胁迫和机械损伤等相关的顺式作用元件。基因组织表达模式分析表明,烟草的碳酸酐酶基因不同成员在不同组织表达水平存在差异,并呈现出时空特异性。本研究结果为烟草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基础。     

烟草病程相关蛋白NtPR10基因克隆与表达分析

为鉴定烟草病程相关蛋白PR10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt PR10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TMHMM、Signal P、Prosite Scan等软件分析发现,Nt PR10不含跨膜区,无信号肽,有胞内定位特征。采用实时荧光定量PCR分别分析了TMV诱导下该基因在抗、感品种枯斑三生和G28中的表达模式。结果表明,在TMV诱导下,Nt PR10基因在感病品种G28中显著上调表达;而在抗病品种枯斑三生中,TMV侵染后6 h,Nt PR10基因显著上调表达,第12小时至第8天显著下调表达,而后至第16天逐渐升高至侵染前水平。综合以上结果,Nt PR10应答了TMV侵染过程,并且在抗、感品种中整体呈现出相反的表达趋势,暗示了Nt PR10在TMV侵染过程中具有重要功能,为深入分析Nt PR10的抗病生物学功能奠定了基础。     

烟草硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表达分析

植物NRT2基因家族(高亲和硝酸盐转运蛋白基因)在植物吸收和转运硝酸盐过程中发挥重要作用。本研究根据NRT2基因家族的保守序列设计兼并引物,扩增出一条821bp序列,以此序列为信息探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从烟草中克隆获得一个包含1593bp开放阅读框、编码530个氨基酸的c DNA序列,命名为Nt NRT2.4。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质具有NRT家族的共有结构特征,与烟草已发现的三个本家族基因同源性达到77.54%,与拟南芥NRT2家族基因同源性达到81.63%,其启动子中包含多个与硝酸盐、光照及根系特异表达相关的元件;组织特异表达分析结果显示,烟草Nt NRT2.4基因的组织表达差异较大,在根部的表达量较高,在叶片和茎部的表达量低;不同氮素形态、光照和蔗糖处理下的基因表达分析结果表明,硝态氮、光照和蔗糖处理诱导Nt NRT2.4表达,而铵态氮抑制其表达。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

NtNramp1基因参与不同镉积累基因型烟草品种镉积累差异的功能解析

【目的】探究不同品种烟草镉积累差异的分子机制。【方法】采用同源克隆方法从烟草不同镉积累基因型品种中克隆拟南芥At Nramp1同源基因Nt Nramp1;应用生物信息学方法分析烟草不同镉积累基因型品种中Nt Nramp1基因序列差异;通过酵母异源表达系统研究烟草不同镉积累基因型品种的Nt Nramp1对镉的转运活性差异。【结果】金英和Komotini Basma两个烟草品种对镉的积累存在显著差异;从镉积累显著差异的两个烟草品种中克隆到的Nt Nramp1基因(分别命名为Nt Nramp1a和Nt Nramp1b)编码区存在57个单碱基差异,其中Nt Nramp1a 1305位碱基变异(GA)导致所编码蛋白比Nt Nramp1b编码蛋白缺少C端两次跨膜;酵母异源表达结果表明来自低镉含量品种金英的Nt Nramp1a转运镉的活性比来自高镉含量品种Komotini Basma的Nt Nramp1b转运镉活性显著降低。【结论】金英和Komotini Basma两个烟草品种中Nt Nramp1蛋白活性差异是导致两烟草品种镉积累差异的重要原因。