抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶(AP)相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。     

抗克伦特罗单链抗体基因工程菌株发醇条件的研究

重组大肠杆菌BL21携带抗克伦特罗单链抗体(seFv)基因,研究了不同培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH以及装液量对重组抗体表达量的影响,并对重组质粒稳定性进行研究.结果表明,在初始pH为7.2、装液量为25mL/250mL的LB培养基中,30℃培养菌体生长至A60onm为0.8时,42℃诱导表达6h,scFv表达量可达33.7%.工程菌在无选择压力条件下连续传代120代,保持稳定,100%的菌株携带重组质粒且经诱导后均有重组抗体的表达.     

抗克伦特罗单链抗体可溶性表达及特性鉴定

目的:表达抗克伦特罗(CBL)可溶性单链抗体(scFv)并进行抗原结合活性鉴定。方法:利用呈现scFv的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导可溶性scFv表达。渗透休克法提取菌体细胞周质腔中scFv。经SDS-PAGE、Western-Blotting以及间接ELISA法分析检测可溶性scFv的表达,并采用间接竞争ELISA法鉴定scFv的抗原结合活性。结果:细菌培养上清及周质腔中均有抗CBL可溶性scFv表达,其分子量约为29kD;上清液及周质腔中scFv效价分别为1:80,1:1600,能够被CBL竞争性抑制,IC50分别为0.78、0.95ng/ml。结论:可溶性抗CBLscFv在大肠杆菌HB2151中获得成功表达,表达的scFv与CBL具有很好的结合活性,可用于进一步建立CBL相应的免疫学检测方法。     

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定

采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿（malachite green,MG）单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly4Ser)3连接,形成单链抗体（single chain variable fragment,scFv）基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,PhoA）基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白scFv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC50为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。     

拟除虫菊酯类农药单链可变区抗体的制备、 鉴定及其特异性分析

目的制备拟除虫菊酯类农药可溶性单链可变区(single-chain fragment variable,scFv)抗体,鉴定其免疫活性并对其特异性进行分析。方法构建表达载体pET28a(+)-scFv和pET42a(+)-scFv并转化BL21(DE3),重组菌经诱导后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定目的蛋白的表达。可溶性融合蛋白scFv/GST经Glutathione Sepharose 4B纯化后用FactorXa切除GST标签获得scFv,然后采用Western blotting法对其进行鉴定。scFv对7种拟除虫菊酯类农药的特异性采用间接竞争酶联免疫法进行分析。结果经0.1mmol/LIPTG诱导后,重组菌BL21(DE3)-p ET28a(+)-scFv和BL21(DE3)-pET42a(+)-scFv表达的目标蛋白分别为包涵体抗体和部分可溶性抗体。经鉴定,可溶性scFv相对分子量约为30k Da,效价为1:25600。同源半抗原Hap1对单链抗体sc Fv的IC50为2.43μg/mL,检出限为0.045μg/mL;scFv抗体对氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯均有较高特异性,IC50分别为3.29、4.72和5.55μg/mL。结论本研究成功获得了拟除虫菊酯类农药的可溶性单链可变区抗体,该抗体对3种拟除虫菊酯农药具有很强的特异性,该研究可为拟除虫菊酯类农药多残留免疫分析提供依据。     

基于ELISA克罗诺杆菌单链抗体制备与鉴定

利用基因工程技术制备克罗诺杆菌特异性单链抗体(sc Fv)。从克罗诺杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,利用RT-PCR反转录合成第一链c DNA后再扩增出抗体的重链可变区(VH)和轻链变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR的方法,用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)3将VH基因和VL基因拼接成sc Fv基因片段,XhoⅠ﹑Eco RⅠ限制性内切酶双酶切sc Fv后克隆到原核表达载体p ET-26b中构建重组质粒sc Fv-pet-26b,挑取阳性克隆提取重组质粒后转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,通过His柱进行亲和层析,最后利用ELISA检测单链抗体的活性。成功构建了表达克罗诺杆菌单链抗体的基因工程菌株,通过SDS-PAGE和ELISA试验结果表明,诱导表达的罗诺杆菌单链抗体分子量约为30 k Da,其能与罗诺杆菌特异性结合,可作为免疫检测罗诺杆菌的候选抗体分子。     

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。     

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体(CBL scFv)的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD 19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。