二硫键影响GH11木聚糖酶稳定性研究进展

低聚木糖具有改善肠道微生态的益生作用,在降血糖、降血压、防止便秘等方面表现出良好的保健效果。近年来,利用生物酶技术制备功能性低聚木糖的相关研究受到广泛关注。糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)11家族木聚糖酶具有底物特异性强和催化效率高的特点,在低聚木糖生产应用中表现出显著优势;然而,大多数天然GH11木聚糖酶存在稳定性较差的问题,无法满足工业生产中高温、酸、碱等极端条件的要求。利用酶工程技术对天然木聚糖酶进行分子改造,以适应高温、酸、碱等生产条件,使底物特异性强、催化效率高的酶相对稳定地发挥作用,对于制备功能性低聚木糖的工业生产具有重要的实际意义。根据GH11木聚糖酶的分子结构及其特点,通过比较其分子内相互作用力对酶热稳定性的影响,发现二硫键在改善酶的稳定性方面具有十分显著的优势。基于对GH11木聚糖酶结构的分析,总结了引入二硫键的常规策略,比较了酶在不同区域引入不同数量二硫键对GH11木聚糖酶稳定性的改善效果,对引入二硫键后酶稳定性显著变化的几个区域进行定位,并指出多个二硫键对改善酶稳定性的作用方式,希望为提高酶稳定性的酶分子改造研究提供基础数据,为拓宽GH11木聚糖酶工业应用范围提供科学参考。     

Loop结构引入半胱氨酸对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

为了探究Loop结构引入半胱氨酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响，以溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP 1030-1木聚糖酶XynASP Loop结构为研究对象，通过定点突变技术，将第95位点天冬酰胺（Asn）突变成半胱氨酸（Cys），获得突变体XynN95C，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达。酶学性质分析结果表明，突变体XynN95C最适温度为50 ℃，酶活性半衰期t1/240 ℃为38 min，相比野生型XynASP分别提高了5 ℃、18 min，最适pH从6.0降至5.0。另外，XynN95C的金属离子耐受性较强，经Fe3+处理1 h，相对酶活性为93.9%，较野生型（65.9%）明显提高。由此得出，在Loop结构引入半胱氨酸可有效提高木聚糖酶的热稳定性，这为GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造又提供一新思路。     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

N-端二硫键及芳香族氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

为提高GH11家族中温木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性,将其N-端替换成GH11家族的耐热性木聚糖酶Ev Xyn11的相应序列,并在该段序列引入芳香族氨基酸残基(P9Y、H14F),构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34,将木聚糖酶基因xyn ZF-2和xyn EV-34分别在E.coli BL21中表达,并分析温度和p H对酶活性的影响。结果表明,杂合木聚糖酶Xyn EV-34的最适温度为48℃,相比原酶Xyn ZF-2提高了8℃。在40℃保温1 h,原酶Xyn ZF-2残余酶活性下降到44.36%,而突变酶Xyn34残余酶活性为77.96%。在45℃,突变酶Xyn EV-34的半衰期t1/245℃为23 min,较重组酶Xyn ZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同时,两种酶的最适p H均为5.0,但p H稳定性由原来的4.4~9.0扩增到了3.0~9.0。由此表明,二硫键以及芳香族氨基酸的引入,对该酶的热稳定性以及p H稳定性都有明显改善。     

F/10木聚糖酶研究进展

木聚糖酶广泛应用在食品加工、纸浆漂白、饲料添加剂、工业乙醇的生产,生物转化等领域.相对于G/11木聚糖酶,F/10家族在稳定性、耐酸性和耐碱性方面更有优越性,本文综述了该家族木聚糖酶的相关基因,酶分子空间结构及催化机理等基本特性,特别对热稳定性属性及基因工程改造其稳定方面进行了详细说明,为进一步进行酶分子改造和应用提供借鉴.     

木聚糖酶EvXyn11TS N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析

系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11~(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11~(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11~(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11~(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。     

木聚糖酶的分子进化

运用生物信息学方法,通过构建木聚糖酶进化树,研究了两个家族的分子进化,发现它们进化模式有差别,F/10家族木聚糖酶在进化时间上较早,功能分化不太完全,具有部分糖苷酶属性,在分解产物中含有较多单糖;而G/11家族木聚糖酶在进化时间则相对较近,多在真菌中出现,功能分化较为完全,很少含有糖苷酶的属性,分解产物中低聚寡糖成分较多.F/10木聚糖酶分子进化显示出生物进化来源于高温环境,热稳定性比G/11木聚糖酶高,这与它们三维结构的不同有关.所以,木聚糖酶的进化方向是功能的进一步分化和底物特异性的进一步增加,这个结果对木聚糖酶的合理应用具有指导意义.     

双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究

木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域DockerinΙ。在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶。将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与p H值分别为60℃、6. 0,且在60℃以下或p H 4. 5～10. 5的范围内有较好的稳定性。水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖。     

不同来源木聚糖酶酶学性质研究

目的 研究比较4种不同来源木聚糖酶的酶学性质,为各酶在不同领域应用提供理论依据.方法 通过摇瓶发酵获得源自4种菌株的木聚糖酶粗酶液,用二硝基水杨酸（DNS）法测定各木聚糖酶的酶活性,并研究酶学性质.结果 嗜热棉毛菌、绿色木霉、泡盛曲霉和橄榄绿链霉菌来源的木聚糖酶的最适温度分别为70,60,50和60℃;最适pH分别为6,4,4和6.嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶耐热性最强,高温60℃下,酶活性高于85％,70℃仍保持60％以上的酶活性,且在pH4～11的范围内能保持较高稳定性.另外3种来源的木聚糖酶则有较强的耐酸性.结论 嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶有饲料添加剂方面的应用优势.另外3种来源的木聚糖酶可根据不同行业对木聚糖酶的要求,应用于食品、医药、能源、环境等领域.     

N-端置换提高木聚糖酶AoXyn11A的耐热性

为提高米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其N-端置换为来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同一家族耐热木聚糖酶pXYL11的对应区域。基于木聚糖酶耐热性的理性设计,采用大引物PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)的5′-端DNA片段置换为pXYL11人工合成基因(xyn11PM)的对应片段,构建出杂合木聚糖酶ATX11A基因(ATx11A)。分别将Aoxyn11A和ATx11A在毕赤酵母GS115中进行了表达,并分析了重组表达产物AoXyn11A和ATX11A的温度特性。结果表明:ATX11A的最适温度T_(opt)由AoXyn11A的50℃提升至65℃,在60℃的半衰期t_(1/2)~(60)为55 min,较AoXyn11A延长了41.3倍;ATX11A在55℃处理3 h保留60%以上的酶活性,而AoXyn11A处理15 min酶活性完全丧失。本研究通过N-端置换显著改善了AoXyn11A的温度特性。     

Functional Characterization of the GH10 and GH11 Xylanases from Streptomyces olivaceoviridis E-86 Provide Insights into the Advantage of GH11 Xylanase in Catalyzing Biomass Degradation

We functionally characterized the GH10 xylanase (SoXyn10A) and the GH11 xylanase (SoXyn11B) derived from the actinomycete Streptomyces olivaceoviridis E-86. Each enzyme exhibited differences in the produced reducing power upon degradation of xylan substrates. SoXyn10A produced higher reducing power than SoXyn11B. Gel filtration of the hydrolysates generated by both enzymes revealed that the original substrate was completely decomposed. Enzyme mixtures of SoXyn10A and SoXyn11B produced the same level of reducing power as SoXyn10A alone. These observations were in good agreement with the composition of the hydrolysis products. The hydrolysis products derived from the incubation of soluble birchwood xylan with a mixture of SoXyn10A and SoXyn11B produced the same products as SoXyn10A alone with similar compositions. Furthermore, the addition of SoXyn10A following SoXyn11B-mediated digestion of xylan produced the same products as SoXyn10A alone with similar compositions. Thus, it was hypothesized that SoXyn10A could degrade xylans to a smaller size than SoXyn11B. In contrast to the soluble xylans as the substrate, the produced reducing power generated by both enzymes was not significantly different when pretreated milled bagasses were used as substrates. Quantification of the pentose content in the milled bagasse residues after the enzyme digestions revealed that SoXyn11B hydrolyzed xylans in pretreated milled bagasses much more efficiently than SoXyn10A. These data suggested that the GH10 xylanases can degrade soluble xylans smaller than the GH11 xylanases. However, the GH11 xylanases may be more efficient at catalyzing xylan degradation in natural environments (e.g. biomass) where xylans interact with celluloses and lignins.     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

Rheological Effects of Some Xylanase on Doughs from High and Low Extraction Flours

The xylanases are widely used in breadmaking with positive effects on bread quality but how they act in doughs is not fully understand yet. The aim of this study is to determine how different xylanolytic preparations modify the rheology of dough prepared from low and high extraction flours and the correlation between the rheological changes induced in dough and the viscosity and xylan content of flour extracts. Four flours, two white and two black, and three xylanolytic preparation was used in study. The rheological characteristics of dough were measured with the Extensograph. The xylan content and viscosity of flour extracts with xylanase were determined. In doughs from white flours xylanases increased the energy, maximum resistance and extensibility while in doughs from black flours decreased the energy and maximum resistance and increased the extensibility. The extensographic effects of xylanases were compared with their capacity to modify the viscosity and xylan content of aqueous flours extracts. The changes of extensographic indicators are well correlated with the changes of xylan content of extracts for white flour while for black flour correlations were observed with the changes of extracts viscosity. The capacity of xylanases to modify the viscosity of extract and convert the insoluble xylans in soluble xylans could be used to predict the performance of xylanases.     

湿热改性淀粉研究进展

湿热改性(heat-moisture treatment,HMT)是指在淀粉水分含量较低,温度一定的条件下处理一段时间,使淀粉性质发生改变的一种物理改性方法。相对于化学改性方法,该法成本较低且免除了使用化学试剂而造成的环境污染,可以达到改善淀粉特定功能特性的目的,已在淀粉改性方面呈现出良好的应用前景。文章综述淀粉湿热改性对淀粉结构和性质的影响,并阐述湿热改性淀粉的作用机制以及在食品应用中的研究进展。     

花色苷改性及应用研究进展

花色苷是一类最常见并且分布最广的类黄酮化合物,以糖苷的形式存在于自然界中,是许多植物组织中最主要的水溶性色素,因其具有食用安全、抗氧化能力强、可预防各种慢性疾病等优点而应用广泛。但是由于其结构特点,花色苷的稳定性较差、生物利用率较低,此外,花色苷的强亲水性还限制了其在亲脂性基质中的应用。通过物理与化学等方法进行花色苷改性可以提高其亲脂性能以及在外界环境下的稳定性和抗氧化性,为使其具有脂溶性特征提供一种有效解决策略。本文对各种花色苷的改性方法及改性后产品的性能指标进行了综述和比较,为更深层次地展开对花色苷稳定性、脂溶性、生物活性等方面的研究及其在食品、药品等行业中的应用提供参考。     

耐热聚乳酸材料的研究进展

针对工业化生产聚乳酸产品普遍存在力学强度低、韧性差、结晶速度缓慢、结晶度低、耐热性能差等问题,综述了国内外关于提高聚乳酸材料耐热性能的方法及其改性机制,将其总结分为共混改性、链结构改性和结晶改性,其中:共混改性包括聚合物复合改性和填充改性,链结构改性包括共聚改性和交联改性,结晶改性包括添加成核剂改性和加工工艺改性。简要分析了各改性方法的优缺点,重点介绍并讨论了聚乳酸立构复合晶的形成及其影响因素,并对聚乳酸材料的发展方向和前景进行了分析与展望。指出国内外最受青睐的改性方法是通过结晶改性配合加工工艺条件改性进行调控,更高效地改善聚乳酸材料的耐热性能。     

小麦淀粉改性技术及应用研究进展

小麦淀粉是小麦中含量最高的成分，约占籽粒干重的75%，但天然小麦淀粉耐热、耐剪切、耐酸能力差，且易老化回生，在很大程度上影响小麦淀粉功能性能及小麦产品的产品品质，因此小麦淀粉改性技术受到了广泛关注。淀粉颗粒形态及结构的改变会影响其糊化特性、老化特性、水溶性、消化率等功能特性，功能特性的改变可进一步扩大淀粉的应用范围。本文主要论述了小麦淀粉主要改性方法（物理改性、化学改性、酶法改性及复合改性）的改性机制及改性后淀粉性质的变化，并总结了改性小麦淀粉的相关制品以及改性小麦淀粉在不同领域中的应用, 以期为改性小麦淀粉在食品及工业的应用提供参考。     

微纤化纤维的制备及其应用的研究进展

介绍了微纤化纤维（MFC）的制备方法、表面改性、特性及其应用,讨论了原料种类和纤维中纤维素、半纤维素、木素三大化学组分对木质纤维微纤化的影响,阐述了不同的预处理工艺对制备MFC的促进作用。