鱿鱼墨多肽制备及其诱导DU-145和PC-3细胞早期凋亡研究

目的:研究鱿鱼墨多肽酸法提取工艺及不同浓度鱿鱼墨多肽对DU-145和PC-3细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:以料液比、加酸量、酸解时间和酸解温度为因素,以酸解液的氨基氮含量为指标,通过正交试验确定提取鱿鱼墨多肽的酸解条件。采用CCK-8法检测其对DU-145和PC-3的生长抑制作用。采用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测和AO/EB双染法,观察鱿鱼墨多肽对DU-145和PC-3细胞的早期凋亡情况。结果:酸法提取鱿鱼墨多肽最佳组合为0.02 mol/L盐酸、酸提料液比1∶1、酸解时间2 h、酸解温度35℃;鱿鱼墨多肽对DU-145和PC-3细胞有增殖抑制作用,能诱导DU-145和PC-3细胞凋亡。结论:鱿鱼墨多肽能抑制DU-145和PC-3细胞增殖,并诱导其细胞凋亡。     

乌贼墨多肽诱导人前列腺癌DU-145细胞凋亡的机制研究

本文探讨了乌贼墨多肽(SHP)诱导DU-145细胞凋亡机制。采用CCK-8法检测SHP对DU-145细胞增殖的影响;采用HE染色和AO/EB荧光染色观察DU-145细胞的形态学的变化;采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率;并通过Western Blotting检测细胞中p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF的蛋白表达变化。结果表明,SHP对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用且呈现剂量和时间依赖性;SHP作用后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征;流式细胞术结果显示,随着SHP浓度和作用时间的增加,DU-145细胞的早期凋亡率从12.25%增加到34.20%;Western Blotting结果显示,当SHP作用24 h后,VEGF、Bcl-2蛋白表达量降低,p53、Bax、Caspase-3蛋白表达量增加。综上可知,SHP能够诱导DU-145细胞凋亡,其机制有可能是通过激活抑癌基因p53,下调Bcl-2/Bax比例;下调VEGF,激活凋亡蛋白酶Caspase-3,诱发凋亡级联反应来实现的。     

黄鱼鱼鳔肽分离及其诱导前列腺癌DU-145细胞凋亡的机制

为探讨黄鱼鱼鳔肽诱导前列腺癌DU-145细胞凋亡的作用机制,从黄鱼鱼鳔酶解产物中分离纯化得到鱼鳔肽,鉴定其氨基酸序列。采用CCK-8法检测鱼鳔肽作用后DU-145细胞抑制率的变化;AO/EB法检测DU-145细胞凋亡情况;流式细胞术检测DU-145细胞凋亡率和周期;免疫印记法检测DU-145细胞凋亡蛋白表达。结果表明,分离得到的鱼鳔肽YCSB-1c中包含Ser-Pro-Ser-Pro和Gly-Pro-Ala-Arg两条寡肽。与空白组相比,YCSB-1c组中凋亡细胞明显增多,且呈质量浓度依赖性;流式细胞仪检测得出YCSB-1c组中存活细胞明显减少,晚期凋亡细胞明显增多。YCSB-1c将DU-145细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,上调Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达,诱导DU-145细胞凋亡。YCSB-1c能有效诱导DU-145细胞凋亡,其作用机制与细胞周期停滞和线粒体介导的凋亡途径有关。     

榆干离褶伞溶栓酶对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的：探讨榆干离褶伞（Lyophyllum ulmarium,L.u）溶栓酶对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC）损伤的保护作用。方法：用H2O2诱导HUVEC氧化损伤,采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法观察细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）和总活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blotting法检测Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等蛋白的表达水平。结果：L.u溶栓酶可显著提高HUVEC的存活率,明显抑制H2O2诱导的细胞内ROS生成和线粒体跨膜电位的下降,并能降低Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。结论：L.u溶栓酶对氧化应激损伤的HUVEC有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡有关。     

罗非鱼鱼皮胶原多肽对体外肠道肿瘤的影响

目的：体外研究罗非鱼鱼皮胶原多肽对人结肠癌细胞系LoVo增殖能力的影响,并初步探讨其作用机理。方法：体外培养人结肠癌LoVo细胞,噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tertrazolium bromide,MTT）法检测罗非鱼鱼皮胶原多肽对细胞增殖的影响;荧光探针染色法观察细胞膜及核的变化;激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）表达;比色法检测细胞线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ和Ⅲ的活性。结果：罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞的增殖具有一定的抑制作用,当质量浓度为100 mg/mL、作用48 h时,抑制率达到55.03%（P＜0.05）;与空白对照组相比,经胶原多肽作用后,LoVo细胞核浓缩,细胞膜出现不完整,细胞凋亡;且细胞内活性氧水平表达显著增加（P＜0.05）,细胞内线粒体呼吸链复合物Ⅲ的活性显著降低（P＜0.05）,但对线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性无影响。结论：罗非鱼鱼皮胶原多肽对人结肠癌细胞具有一定的增殖抑制作用,可能与抑制线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性,使胞内ROS水平增加,破坏细胞膜形态有关。     

原花青素B2诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其作用机制

本研究旨在探讨原花青素B2（procyanidin B2,PCB2）对人乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用及其机制。采用噻唑蓝法分析PCB2在不同浓度和不同处理时间下对MCF-7细胞存活率的影响;通过激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2＋浓度变化并观察Hoechst 33342染色后的细胞凋亡形态;采用流式细胞分析仪检测PCB2对MCF-7细胞凋亡率、周期、胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平及线粒体膜电位变化的影响;通过Western blot检测PCB2对MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达量的影响。结果表明,当浓度在10～80 μmol/L范围内时,PCB2能显著降低MCF-7细胞的存活率（P＜0.05）,且呈浓度依赖性,处理24、48、72 h时对MCF-7细胞存活率的半抑制浓度分别为114.82、57.15 μmol/L和55.64 μmol/L。PCB2能显著增加MCF-7细胞凋亡率、胞内ROS水平（P＜0.05）、细胞核荧光强度,并破坏Ca2＋平衡,同时显著降低线粒体膜电位（P＜0.05）,并将细胞周期阻滞在G0/G1期进而诱导细胞凋亡。PCB2可上调Bax、细胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白的相对表达水平,下调Bcl-2蛋白相对表达水平。综上可知,PCB2具有抗肿瘤作用,其机制与激活线粒体和内质网介导的凋亡通路、周期阻滞和细胞内ROS水平增加有关。     

蓝莓花色苷对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用

为探究蓝莓花色苷（BA）对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用及其机制,通过MTT法测定A549细胞存活率,采用ELISA法检测细胞内丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性,采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平,采用流式细胞分析仪测定细胞凋亡率,通过RT-PCR技术测定细胞内抗氧化酶和凋亡相关蛋白的mRNA表达量,用免疫印迹法（Western blot）测定凋亡相关蛋白表达量。结果表明：选择H2O2浓度400 μmol/L、处理时间24 h来构建细胞氧化损伤模型。BA质量浓度为30,60,90 mg/mL对A549细胞无毒性作用;BA能显著抑制H2O2造成的A549细胞存活率降低（P<0.05）,同时显著降低细胞凋亡率、MDA和胞内ROS水平（P<0.05）,显著增加GSH-Px、SOD和CAT活性及其相对mRNA表达量（P<0.05）,并显著上调Bcl-2/Bax的比值和下调Cytochrome c、Caspase-9和Caspase-3相对mRNA和蛋白表达量（P<0.05）。BA对H2O2诱导A549细胞氧化损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制细胞凋亡通路相关蛋白的表达,提高胞内抗氧化酶活性,清除胞内过量ROS,降低细胞凋亡率有关。     

阿魏酸拮抗PM2.5对A549细胞线粒体的损伤作用

研究阿魏酸是否具有拮抗PM2.5致线粒体损伤作用及拮抗机制。实验分为空白对照组、PM2.5(240 μg/m L(损伤组和阿魏酸(80 mmol/L)保护组。通过Mito SOX Red特异性探针和流式细胞仪测定细胞线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Annexin-V/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率;JC-1染色法流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化;活体细胞线粒体膜通道孔荧光检测试剂盒检测细胞线粒体膜通道孔(mitochondrial permeablity transition pore,m PTP)的开放情况;Western blot法检测caspase-3、caspase-9、含锰金属辅基的超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)和过氧化物酶增殖体激活受体γ共激活因子-1α(subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α,PGC-1α)相关蛋白表达量。结果显示,与空白对照组比较,PM2.5损伤组的细胞ROS含量、caspase-3和caspase-9表达量及细胞凋亡率升高,线粒体膜电位和m PTP活性及PGC-1α、Mn SOD的表达量降低;阿魏酸预处理后,显著降低了PM2.5造成的A549细胞ROS的含量、细胞凋亡率及caspase-3和caspase-9表达量的升高,显著升高了PM2.5致A549细胞线粒体的膜电位、m PTP的活性及PGC-1α和Mn SOD表达量的降低。阿魏酸对PM2.5致A549细胞线粒体损伤具有明显的保护作用。     

草苁蓉多糖对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡的抑制作用

目的：研究草苁蓉多糖（Boschniakia rossica polysaccharides,BRPS）对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡 的抑制作用。方法：利用叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,tBHP）损伤人脐静脉血管内皮细胞制备细胞 氧化应激损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）比色法检测细胞存 活率,分光光度法检测细胞内丙二醛（malondialdelyde,MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活力和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）水平。采用二氯荧光乙酰乙酸盐（dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,采用JC-1荧光染色法观察 细胞线粒体跨膜电位（mitochondrial membrane potentials,ΔΨm）水平,采用Hoechst染色和原位末端标记（TdTmediated dUTP nick end labeling,TUNEL）法观察细胞凋亡情况。Western blot法检测细胞Bax、Bcl-2、细胞色素c （cytochrome c,Cyt c）、Bid片段（truncated Bid,tBid）、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况。 结果：BRPS提高tBHP损伤的内皮细胞存活率,降低细胞ROS水平,减少MDA生成,提高SOD活性与GSH水 平,升高ΔΨm水平,抑制细胞凋亡。Western blot结果显示,BRPS降低胞浆Cyt c、线粒体tBid水平,减小细胞 Bax/Bcl-2比值,抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化。结论：BRPS对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡具有 抑制作用,机制可能与线粒体凋亡途径和死亡受体途径均有关。     

硒酸软骨多糖对K562细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

本文研究了硒酸软骨多糖(CA-Se)对K562人慢性髓源白血病细胞线粒体膜电位的影响,及对K562细胞的凋亡诱导作用。采用MTT比色法测定CA-Se对K562细胞的增殖抑制作用;Hoechst 33342/PI染色后于显微镜下观察细胞的形态变化;罗丹明-123染色后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化;采用免疫荧光法检测caspase-9蛋白表达水平,并用RT-PCR检测其基因的表达。结果表明:CA-Se可显著抑制K562细胞的增殖,且具有浓度依赖性和时间依赖性;经CA-Se作用后,细胞形态发生明显改变,细胞体积变小,细胞膜变得不规则,染色质固缩;对照组与CA-Se处理组的线粒体膜电位分别为96.10%和78.07%,膜电位下降;CA-Se处理后,K562细胞中caspase-9蛋白表达显著增加,其基因表达水平显著上升。说明硒酸软骨多糖可通过降低细胞线粒体膜电位,上调凋亡起始酶caspase-9的基因表达,激活caspase-9蛋白来诱导K562细胞凋亡。     

双齿围沙蚕多肽的制备及其抗肺癌A549细胞活性

探讨双齿围沙蚕酶解多肽制备的关键技术及其对肺癌A549细胞的作用。以增殖抑制率为指标,确定最佳酶种并根据单因素试验和正交试验确定其最佳酶解工艺。经超滤获得1~3 ku的酶解液,通过阴离子色谱、凝胶过滤色谱和制备色谱对其进行进一步的分离纯化。采用四甲基偶氮唑蓝法测定沙蚕多肽PAP对肺癌A549细胞的增殖抑制率并通过倒置显微镜、吖啶橙/溴化乙锭荧光染色及Hoechst荧光染色观察其细胞形态的变化。实验结果表明最佳酶种是碱性蛋白酶,其最佳酶解条件为:酶解温度50℃、pH 11、料液比1∶1(g/mL)、酶解时间6 h、加酶量300 U/g。经纯化获得的多肽命名为PAP,其氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe,且PAP对A549细胞的作用呈时间与剂量依赖关系,作用后细胞出现了凋亡的形态学特征。因此,PAP能明显抑制肺癌细胞A549增殖,可以诱导其发生凋亡而发挥抗肿瘤作用。     

卵白蛋白抗氧化肽分离与纯化

目的:从卵白蛋白酶解液中分离抗氧化肽.方法:通过超滤、离子色谱和反相高效液相色谱法从卵白蛋白酶解液中分离制备抗氧化肽,用电喷雾质谱肽的结构进行表征.结果:分离纯化获得抗氧化能力较强的3个肽:OPQ3-1、OPQ3-2和OPQ3-4,分别是源于鸡蛋卵白蛋白第115～117氨基酸残基(Pro-Glu-Tyr),分子质量408.14 Da;第245～248氨基酸残基(Leu-Pro-Asp-Glu),分子质量473.19 Da;第148～150氨基酸残基(Trp-Val-Glu),分子质量433.18 Da.结论:卵白蛋白经胃蛋白酶水解获得抗氧化多肽.     

Purification and identification of immunomodulating peptides from enzymatic hydrolysates of Alaska pollock frame

To prepare immunomodulating peptides from Alaska pollock frame (APF) hydrolysates, trypsin was employed for enzymatic hydrolysis, and the immunomodulating activities of the hydrolysates were studied using splenic lymphocytes proliferation assay. The highest activity of the hydrolysates was reached when DH ranged from 15% to 18%. The peptide fractions which exhibited the highest activity were further purified using ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and RP-HPLC. The peptides were identified using nano-LC-ESI mass spectrometry. Finally, three immunomodulating peptides were obtained, and the amino acid sequences were Asn-Gly-Met-Thr-Tyr, Asn-Gly-Leu-Ala-Pro, and Trp-Thr, respectively. The lymphocyte proliferation rates were 35.92%, 32.96%, and 31.35% in the presence of 20 μg/ml purified peptides, respectively. Therefore, the results demonstrated that the APF proteins hydrolysates prepared by trypsin could serve as a source of peptides with immunomodulating activity. It provided a scientific basis for the preparation of immunomodulating peptides.     

米糠蛋白类阿片拮抗肽的分离纯化

采用体积排阻色谱和反相高效液相(RP-HPLC)对米糠蛋白酶解物进行分离纯化,得到一种具有较高活性的类阿片拮抗肽,体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC)测定它的相对分子质量为546Da。     

羊栖菜褐藻糖胶的分离纯化和组成性质研究

对羊栖菜褐藻糖胶的7种组分进行了分离纯化和性质研究。首先以羊栖菜为原料,通过CaCl2法和酸法抽提褐藻糖胶,然后经DEAE-Cellulose52离子交换柱层析和SephadexG-100凝胶柱层析,分离得到了7个组分,经纸层析和紫外扫描证实均为单一组分。其次对7个组分的性质进行了研究,经GPC凝胶排阻色谱、气相色谱和红外光谱对各组分的相对分子质量、单糖组成、结构性质等进行了测定;经HIO4氧化法和比浊法对各组分的岩藻糖和硫酸根含量进行了测定;最后通过MTT法,研究了各组分对DU-145和SPC-A1细胞的作用,结果表明各组分对该二种癌细胞的增殖均有抑制作用。     

分步酶解小麦面筋蛋白制备低苦味肽粉的研究

目的 研究分步酶解小麦面筋蛋白(wheat gluten, WG)制备低苦味肽粉的工艺。方法 选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解WG至8%水解度,接着用风味蛋白酶对水解产物进行脱苦处理,对不同酶解产物中苦味肽的特性进行系统研究,探究苦味肽含量、氨基酸组成、分子量分布、表面疏水性等指标变化对WG酶解物苦味值的影响,对比风味蛋白酶对不同单酶酶解物的脱苦效果差异,分析风味蛋白酶对WG酶解物脱苦的内在机理,进而确定制备低苦味小麦蛋白肽粉的最佳酶解工艺。结果 中性蛋白酶的酶解产物经风味蛋白酶作用后,脱苦效果最显著,苦味肽苦味值从4.08降至2.25,酶解产物的苦味值可下降56.42%。木瓜蛋白酶的酶解产物经风味蛋白酶作用4 h后,酶解产物的苦味值最低,制备出苦味值为1.28的WG低苦味肽粉。结论 经分步酶解作用后,酶解产物中苦味肽的含量下降;疏水性氨基酸比例的下降和游离氨基酸含量的升高引起苦味肽苦味阈值的增大,共同导致酶解产物苦味值显著降低,该研究为酶解脱苦技术的快速发展和WG活性肽工业化生产提供新的参考。     

Characterization of hydrolysates produced by mild-acid treatment and enzymatic hydrolysis of defatted soybean flour

Acid (0.05–0.2 N HCl) pre-treatments and subsequent enzymatic hydrolysis (Alcalase™ and Flavourzyme™) of defatted soybean flour (DSF) were performed under aseptic conditions. The acid pre-treatment facilitated enzymatic hydrolysis of the protein in DSF by increasing the nitrogen solubility index. Protein was hydrolyzed primarily during the first 5 h of enzymatic hydrolysis. The degree of hydrolysis and α-amino nitrogen contents of the hydrolysates increased after acid pretreatment. The average peptide chain lengths were estimated at 7∼8 amino acid units after 3 h hydrolyzation by Alcalase, and 3–5 amino acid units after 21 h by Flavourzyme/Alcalase mixture. Gel permeation chromatography provided molecular size distribution to determine the molecular weights of the corresponding hydrolysates. At the end of 24 h enzymatic hydrolysis, the amounts of free amino acid, dipeptide and tripeptide accounted for almost half of the proteins in the hydrolysate, while the oligopeptides constituted 40%.     

酶解法制备榛子粕ACE抑制肽工艺研究

以榛子粕为原料,利用中性蛋白酶酶解制备ACE抑制肽。以酶解产物的ACE抑制率为指标,采用单因素试验分别考察底物质量分数、酶用量、酶解温度、pH和酶解时间的影响。在单因素试验基础上设计响应面Box-Behnken中心组合试验对酶解条件进行优化。结果表明:榛子粕最佳酶解工艺条件为底物质量分数5%、酶用量0.3%、酶解温度40℃、pH7.5、酶解时间1.5h,在此条件下榛子粕酶解产物的ACE抑制率达到91.76%。     

谷朊粉酶解物的制备及其ACE抑制肽的分离鉴定

以谷朊粉为原料,以血管紧张素转换酶（ACE）抑制率为指标,比较4种蛋白酶的酶解效果。采用超滤、葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱（RP-HPLC）的方法分离纯化ACE抑制肽并用电喷雾飞行时间质谱联用(ESI-TOF-MS)鉴定其结构。结果表明：碱性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物具有较高的ACE抑制活性;超滤后,分子质量Mr<1 ku的组分具有较高的ACE抑制率;分离纯化后得到小肽的ACE抑制率高达（81.03±1.20）%;由ESI-TOF-MS质谱图得出该小肽的m/z为630.89,氨基酸序列为Trp-Phe-Gln-Pro（WFQP）。