单增李斯特菌(EGDe)sigB基因缺失株的构建及其生物特性的初步鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患的食源性致病菌,在感染过程中可以穿越人体肠道屏障、胎盘屏障及血脑屏障,进而引发肠胃炎、脑膜炎及孕妇流产等疾病。Sigma B(sigB)基因编码产生的sigma B因子是许多革兰氏阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子,并且直接或间接的调控Lm中相关重要毒力基因如prf A、inl A等的表达。本文通过同源重组技术将Lm野生菌株EGDe的sigB基因敲除,并且对缺失菌株的生长曲线,inl A、inl B、prf A等13种Lm的毒力基因表达水平及对肠道上皮细胞Caco-2的侵袭进行了研究。实验表明,EGDe-ΔsigB基因缺失菌株生长速度与EGDe基本一致;sigB基因的缺失造成inl A和inl B基因表达水平的大幅度下调,但act A和plc A等毒力基因却上调4~5倍,说明sigB基因对于单核增生性李斯特菌的一些毒力基因表达影响比较大;Caco-2细胞的侵袭实验显示EGDe-ΔsigB基因的缺失对Caco-2细胞侵袭能力的下降。     

双基因敲除减毒单增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的构建及其生物学初步鉴定

减毒单增李斯特菌具有成为疫苗活载体的潜力,可同时引起MHCⅠ和MHCⅡ类抗原递呈系统,具有强烈激发CD8+和CD4+细胞免疫的能力。构建毒力基因缺失菌株进而评估其生物活性对于其作为疫苗活载体的开发尤为重要。本文采用同源重组技术构建单缺失菌株Lm-△act A和双缺失菌株Lm-△act A△/inl B,从生长状态、毒力基因表达和对Hep G2细胞侵袭能力方面探讨减毒菌株生物学特性。生长活性测定显示两种减毒菌株和野生型Lm(EGD-e)三者生长状况无差异;实时定量PCR结果显示act A基因缺失后,inl A基因表达水平上升两倍;act A和inl B基因双缺失后,plc B和hly基因的表达水平都有较大幅度的上升;侵袭Hep G2细胞结果显示act A基因缺失后侵袭能力增强、act A和inl B基因共同缺失后侵袭能力减弱。因此,减毒菌株的构建及其生物特性研究不仅对食源性致病菌Lm致病机理具有重要意义,也为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。     

单核增生性李斯特菌hly缺失菌株的构建及生物特性的初步鉴定

为研究单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)hly基因对毒力的影响,利用同源重组原理,使用穿梭载体,构建单核细胞增生性李斯特菌野生菌株EGD-e的hly基因缺失菌株EGD-eΔhly。细菌活性实验证明缺失菌株生长状态与亲本无差异,但EGD-eΔhly丧失溶血活性,细胞侵袭能力降低约90%,在10~7 cells/m L腹腔注射条件下不表现动物毒性。在转录水平上EGD-eΔhly的毒力基因inl C、prf A的表达量分别下降了81%和76%,act A、plc B的表达量分别提高了2.7倍和1.8倍。hly缺失菌株的成功构建及生物特性的初步研究结果为研究Lm致病机理提供依据。     

单增李斯特菌prfA基因缺失菌株的构建及其生物学特性鉴定

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种风险较高的食源性致病菌,其绝大多数毒力基因的表达均受到由prfA基因编码的PrfA(positive regulatory factorA)蛋白全部或部分调控。使用同源重组的方法敲除Lm野生菌株EGDe的prfA基因,并通过测定生长曲线、毒力基因表达和侵袭Caco-2细胞能力等探讨单缺失菌株EGDe-ΔprfA生物学特性。通过测定生长曲线显示prfA敲除株和野生型EGDe二者生长状态无差异;运用实时定量荧光聚合酶链式反应检测EGDe-ΔprfA的主要毒力基因表达,结果显示plcA、plcB毒力基因的表达量分别上升至原来的2.5倍和2倍,inlA、inlB、inlC、actA、vip等均呈下降趋势,prfA基因表达量趋向于零;侵袭Caco-2细胞结果显示EGDe-ΔprfA侵袭数为野生株的1/5。该基因缺失菌株的构建及生物学特性研究对食源性致病菌EGDe致病机理研究具有重要意义并且提供了重要材料。     

群体感应系统对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

以单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）为研究对象,分析Agr群体感应系统和LuxS/AI-2系统对其生物被膜形成的调控作用。通过同源重组对LMB33426菌株进行agrD基因以及luxS基因的无痕敲除,比较野生菌株与agrD、luxS基因缺失菌株的生物被膜特性差异。结果表明,与野生株相比,ΔagrD突变株和ΔluxS突变株的生物被膜形成能力下降;ΔagrD突变株的疏水性显著下降,在37 ℃下的泳动能力较野生株增强;群体感应系统基因敲除对菌株的耐药性没有产生较大影响。基因缺失株的构建为进一步研究群体感应系统对单增李斯特菌生物被膜形成的调控机制提供参考,同时为单增李斯特菌的预防控制奠定了基础。     

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inlA和inlB基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inlA和inlB基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降（P＜0.05）。本研究成功构建LM的inlA和inlB基因双缺失菌株,并初步研究了基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响,为深入研究内化素InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。     

食源性金黄色葡萄球菌粘附素基因的检测及蛋白酶K和DNase Ⅰ对菌株被膜形成的影响

本研究以实验室保存的17株金黄色葡萄球菌食品分离菌株为研究对象,通过提取细菌DNA,采用PCR检测14种粘附素基因的分布情况,随后采用试管法和微孔板法对细菌成膜能力进行检测,进一步研究蛋白酶K和DNaseⅠ对生物被膜形成能力的影响。结果表明:17株菌株均携带clf B基因,检出率为100%,均不携带bap,bbp和clf A基因,有13株菌扩增出ica BC基因(76.5%),12株均扩增出cna基因(70.6%),11株菌扩增出eno基因(64.7%),10株菌分别扩增出fib和ica AD基因(58.8%),9株菌扩增出fnb A基因(52.9%),4株菌分别扩增出sas C,sas G和ebp S基因(23.5%),2株菌扩增出fnb B基因(11.8%)。试管法和微孔板法观察到17株菌株均有生物被膜形成,但不同菌株的被膜形成能力有差异,10号和30号菌株被膜形成能力显著强于其它15株菌(p0.05)。在细菌生长过程中,蛋白酶K、DNaseⅠ以及两种酶的联合处理发现蛋白酶K和DNaseⅠ处理组细菌生物被膜形成能力明显低于对照未处理组(p0.05),并且蛋白酶K对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果比DNaseⅠ好,但是两种酶联合处理效果与对照组差异不显著(p0.05)。本研究旨在为食源性金黄色葡萄球菌生物被膜的形成与控制策略提供基础数据。     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

食品中金黄色葡萄球菌生物被膜形成基因分析及影响因素研究

分析金黄色葡萄球菌食品分离菌株生物被膜形成相关基因,研究茶多酚和乳酸链球菌素(Nisin)对不同菌株生长及生物被膜形成的影响。以实验室保存的16株金黄色葡萄球菌食品分离菌株为研究对象,采用聚合酶链式反应(PCR)检测14种生物被膜形成相关基因;通过微孔板法研究不同浓度茶多酚和Nisin对不同菌株生长的抑制作用,确定最小抑菌浓度(MIC);在此基础上进一步研究茶多酚和Nisin对生物被膜形成能力影响。结果表明:14种生物被膜形成相关基因中有10种被检出,其中cna、ebp S、fib和ica AD基因检出率为100%,sas C为87.5%、fnb A为68.75%、sas G为68.75%、clf B为68.75%、eno为62.5%,ica BC为56.25%;16株菌株中均不携带bbp、bap、clf A和fnb B基因。16株菌株均能形成生物被膜,但形成能力有差异,其中F23、F44、F58、F64、F71、F86、F107和F109等8株菌株为被膜强形成菌株,F7、F19、F40、F46、F60、F99、F101、F106等8株菌株为被膜弱形成菌株。茶多酚和Nisin对16株金黄色葡萄球菌食品分离菌株的MIC范围分别为0.1~0.2 g/L和0.125~1 g/L,茶多酚和Nisin在1/2MIC和1/4MIC浓度下对生物被膜形成抑制作用明显(p0.05),且茶多酚抑制效果强于Nisin。本研究结果为食品中金黄色葡萄球菌生物被膜形成控制具有参考意义。     

食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B. subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B. subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168 (dal)~-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal (Amp~R,Ori)-并转化至BS168 (dal)~-中得到食品级重组菌BS168 (dal)-/p MA5-lap-dal (Amp~R,Ori)~-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7. 0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B. subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。     

单增李斯特菌nox基因的克隆、表达以及功能

以Gen Bank中报道的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)野生型菌株EGDe的nox基因(Gen Bank ID:986631)为研究对象,探讨在高等动植物中普遍存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介导产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。首先通过诱导nox基因在BL21中表达产生Nox蛋白,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定该蛋白质分子质量;然后构建过表达菌株EGDe-nox,测定ROS产生情况,并使用实时荧光定量-聚合酶链式反应检测nox基因的过表达对Lm毒力基因表达的影响。结果表明,经鉴定Nox蛋白分子质量约为33 k D,过表达菌株EGDe-nox与对照组EGDe的ROS产生量相比并无多大变化,nox基因的过表达会导致与侵袭相关的基因act A、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表达上调。由此推测,该Nox蛋白不能独立主导ROS的产量,但其过表达却可以增强毒力基因表达上调。本研究为继续探讨细菌中Nox的作用提供一定的参考依据。     

毒力因子InlA和InlB缺失影响单增李斯特菌侵袭宿主细胞和诱导凋亡的能力

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种毒力较强、人畜共患的食源性致病菌,其具有穿透宿主屏障、胞内寄生的特点,因而致死率较高,被其污染的食品容易引发严重的食品安全问题。本研究使用前期构建的LM重要的毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和InlB基因缺失菌株,以人结肠癌腺细胞Caco-2和人肝癌上皮细胞Hep G2为研究对象,探究InlA和InlB缺失对LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的影响。实验结果表明,InlA和InlB的缺失使LM侵袭宿主细胞的能力明显降低(P0.05),与野生株相比侵袭量下降超过50%,同时也降低了其诱导宿主细胞凋亡的能力(P0.05),与野生株相比凋亡细胞的比例下降幅度达到30%~50%。本实验确定了InlA和InlB在LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的过程中具有重要的作用,有助于对LM的致病机理以及引起宿主相关免疫反应、诱导细胞凋亡相关分子机制的深入研究。     

Roles of outer membrane protein W (OmpW) on survival,morphology, and biofilm formation under NaCl stresses in Cronobacter sakazakii

Cronobacter sakazakii is an important foodborne pathogen associated with rare but severe infections through consumption of powdered infant formula. Tolerance to osmotic stress in Cronobacter has been described. However, the detailed factors involved in tolerance to osmotic stress in C. sakazakii are poorly understood. In this study, roles of outer membrane protein W (OmpW) on survival rates, morphologic changes of cells, and biofilm formation in C. sakazakii under different NaCl concentrations between wild type (WT) and OmpW mutant (ΔOmpW) were determined. The survival rates of ΔOmpW in Luria-Bertani medium with 3.5% or 5.5% NaCl were reduced significantly, and morphological injury of ΔOmpW was significantly increased compared with survival and morphology of WT. Compared with biofilm formation of the WT strain, biofilms in ΔOmpW were significantly increased in Luria-Bertani with 3.5% or 5.5% NaCl using crystal violet staining assay after 48 and 72 h of incubation. Detection of biofilms using confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy further confirmed the changes of biofilm formation under different NaCl stresses. This study demonstrates that OmpW contributes to survival of cells in planktonic mode under NaCl stresses, and biofilm formation is increased in ΔOmpW in response to NaCl stress.     

单增李斯特菌srtA基因敲除菌株的构建及其生物学特性

单核细胞增生性李斯特菌是常见的食源性致病菌,其细胞壁上存在的表面蛋白与其致病性和细菌菌膜的形成密切相关,而srt A基因是介导表面蛋白膜表面定位的关键因子,通过识别特定的蛋白序列将表面蛋白共价结合在细胞壁上,也是单增李斯特菌的重要毒力基因。为深入研究srtA的功能及其对细菌毒力的调控,本研究通过同源重组技术敲除了单增李斯特菌中的srt A基因,并对基因敲除菌株的生物学特性进行了初步研究。通过生长曲线的测定,发现srtA基因敲除株的生长活性低于野生型菌株。进一步利用该菌株对星形胶质细胞系U251的侵袭实验发现,srtA基因敲除菌株的侵袭效率低于野生菌株,提示srtA基因在调控单增李斯特菌的侵袭能力方面发挥重要作用。本研究可为单增李斯特菌毒力基因调控和细菌菌膜的研究提供理论依据。     

CodY在单核细胞增生李斯特菌抗氧化胁迫中的作用

目的：探究全局性转录调控因子CodY在单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）抗氧化应激中的作用。方法：利用H2O2对处于对数中期（OD600 nm=0.65）的Lm野生株EGDe和CodY缺失株EGDeDcodY进行氧化胁迫，比较两菌株氧化耐受能力、抗氧化应激物（过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH））活性或含量差异；通过随机扩增多态性DNA技术比较两菌株基因组模板稳定性（genomic template stability，GTS）；利用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测两菌株抗氧化应激物编码基因以及DNA损伤诱导反应（SOS反应）重要基因的转录表达变化。结果：1）H2O2对EGDe的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度大约是EGDeDcodY的2 倍，当H2O2浓度超过20 mmol/L时，EGDeDcodY抑菌圈直径极显著大于EGDe（P≤0.01）。2）200 mmol/L H2O2完全抑制EGDeDcodY生长而EGDe生长速率则有所减慢。3）H2O2胁迫使EGDe和EGDeDcodY中CAT活力均下降，但转录水平并没有显著变化；SOD活力在两菌株内无明显变化，但转录表达在EGDe和EGDeDcodY中差异高度显著（P≤0.001）；值得注意的是，GSH编码基因的转录表达和其含量在EGDe和EGDeDcodY中变化趋势基本一致，随H2O2胁迫时间延长呈先显著下降后略微上升，而且与EGDe相比，GSH在EGDeDcodY中的转录表达水平具有极显著差异（P≤0.01）。4）EGDe和EGDeDcodY的GTS分别为93.1%和80.0%；real-time PCR显示EGDeDcodY中参与SOS反应的重要基因（recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975）转录表达受到高度显著抑制（P≤0.001），而EGDe中recA、lmo1302和lmo1975的转录表达被激活。结论：CodY缺失导致细菌在H2O2胁迫下的耐受能力和生长速率显著降低，GSH含量下降，GTS降低，参与SOS反应的重要基因表达受到显著抑制，表明CodY在Lm抵御氧化胁迫中发挥了重要的调控作用。