酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺优化及其抑制机制

为优化酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺条件以及筛选和鉴定一种新的ACE抑制肽,选用5种蛋白酶水解酪蛋白,以水解度、分子质量分布和ACE抑制率为指标筛选最适蛋白酶,采用单因素和响应面试验优化工艺,采用三合一质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS)方法鉴定分子质量小于3 ku组分的氨基酸序列,筛选潜在ACE抑制肽,进行人工合成,测定其IC50值。采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接解析肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件为pH 6、底物含量8%、酶添加量4%、温度55 ℃、水解时间90 min,此时酪蛋白水解液ACE抑制率为99.1%。验证具有ACE抑制活性的肽段10条,筛选出一条新颖的降血压肽——LFRQFY(源自αs1-酪蛋白),其ACE抑制活性的IC50为(7.9±1.7)μmol/L,酶抑制动力学为混合抑制模式。分子对接结果表明:LFRQFY能与ACE的氨基酸残基Ala354(活性口袋S1)、His353(活性口袋S2)形成氢键,具有显著的体外降血压活性。     

酶解星虫水溶性蛋白制备降血压肽的工艺研究

以可口革囊星虫水溶性蛋白为原料,利用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解星虫蛋白制备降血压肽;并以酶解产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率为指标,对酶解条件进行优化,确定了星虫蛋白酶解的最佳条件为酶解时间4h、酶解pH为1.8、酶添加量为0.3％ (w/v),温度37℃,所得酶解产物的IC50为1.85mg/mL.同时对酶解产物的体内降血压活性进行了动物实验,研究表明,星虫蛋白降血压肽在给药后1h,收缩压(SBP)开始下降,一直持续8h,SBP平均降低了约17mmHg.     

广西两种星虫营养及生物质量比较分析

分别对光裸方格星虫和可口革囊星虫的虫体和内脏的常规成分、氨基酸组成与营养效价、重金属含量及生物质量、脂肪酸组成等进行测定。结果表明:两种星虫干物质中蛋白质含量在83.6%~86.5%,均含18种氨基酸,蛋白质营养效价符合FAO/WHO理想评分模式,呈味氨基酸含量丰富,DAA/TAA达到40.07%~45.28%。两种星虫富含多种脂肪酸,具有较高的多不饱和脂肪酸比例。重元素分析显示,光裸方格星虫综合生物质量指数<0.2,可口革囊星虫为0.2~0.3之间。结论:光裸方格星虫和可口革囊星虫营养效价相当,虫体比内脏略高;而光裸方格星虫比可口革囊星虫生物质量高。     

基于生物信息学稻米半胱氨酸蛋白酶抑制剂来源生物活性肽的虚拟筛选及分子对接研究

稻米半胖氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)是除贮藏蛋白外一类重要的稻米蛋白,本研究的目的是筛选稻米OC来源的生物活性肽。研究以稻米OC蛋白质序列为对象进行生物信息学分析和计算机辅助酶解,建立OC蛋白虚拟模拟胃肠道消化产物的肽数据库,预测其生物活性肽序列。进一步结合分子对接虚拟筛选具有结合潜力的活性肽并探讨其与靶蛋白的结合位点及作用方式。生物信息学分析表明稻米OC蛋白与大豆球蛋白和稻米谷蛋白类似也是生物活性肽的潜在优良来源;经人体消化酶虚拟水解后能够产生的肽段活性以ACE和DPP-IV抑制为主。分子对接表明虚拟消化产生的两种新的三肽TDW和AGR均能与ACE和DPP-IV活性部位的关键氨基酸残基形成分子间相互作用,对ACE和DPP-IV具有潜在的抑制作用。     

基于生物信息学与分子对接技术对坛紫菜降血压肽的筛选及活性分析

采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶双酶联合水解坛紫菜蛋白（Porphyra haitanensis protein,PHP）制备降血压活性肽,测定了经超滤后各个分子质量PHP酶解液清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）阳离子自由基能力、铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）以及血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性。经质谱鉴定和活性肽数据库BIOPEP以及AHTPDB网站查找筛选活性肽,采用分子对接解释多肽抑制ACE机理,并对双酶酶解PHP动力学进行研究。结果表明：经超滤后的8?个分子质量的坛紫菜多肽组分中,＜0.5?kDa的组分具有最高DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,＜1?kDa的组分具有最高FRAP值,而0.5～1?kDa组分IC50值（（2.21±0.28）mg/mL）最低。经查找筛选出14?条降血压肽,其中4?条肽的序列和对接能量分别为AVP（－5.87?kJ/mol）、GPL（－6.13?kJ/mol）、LDY（－7.65?kJ/mol）和LGYL（－7.78?kJ/mol）。酶解动力学模型预测PHP水解度与实验水解度相对误差在10%以下。本实验基于串联质谱与分子对接技术,通过生物信息筛选和体外活性检测从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽,探究多肽抑制ACE的机理,并建立了描述蛋白可控酶解过程规律的动力学模型,为活性肽的制备提供了参考和借鉴。     

大黄鱼蛋白源ACE抑制三肽的虚拟筛选、体外活性验证及分子机制

本文利用在线数据库对大黄鱼膜突蛋白虚拟酶解,对所得三肽的生物活性、亲水性、吸收、分布、代谢、排泄、毒性等性质进行预测,通过分子对接预测三肽与血管紧张素转化酶（angiotensin-I converting enzyme,ACE）对接能量,同时对其体外ACE抑制活性测定,并阐明与ACE活性位点的分子作用机制。结果表明,获得四种源自大黄鱼的ACE抑制三肽CMK,GWR,WAK和WQK,其IC₅₀值分别为0.19、2.40、0.40和1.10 mmol/L。分子作用机制表明三肽CMK,GWR,WAK和WQK与ACE的S₁口袋关键氨基酸Ala354,Glu384和S₂口袋关键氨基酸His353产生相互作用,而且氢键促进三肽与ACE活性口袋的结合。本研究表明来自大黄鱼蛋白的三肽可以被用于开发预防高血压的功能性食品组分。     

基于定量构效关系制备火麻仁蛋白ACE抑制肽

高血压是引发心血管疾病的主要因素，经常服用降压的药物会产生副作用，因而安全、高效的食源性降压肽成为关注点。本研究建立了血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的定量构效关系(QSAR)模型，确定ACE抑制肽的结构与其活性间的关系。将模型结果辅以计算机虚拟酶切精确掌握蛋白水解位点，筛选合适的蛋白酶水解火麻仁蛋白定向制备ACE抑制肽，并测定最终水解物的抑制效果。结果表明:基于二肽建立的SVM-AAindex模型具有最佳的预测性能(R2为0.81，RMSE为0.53)，且当二肽C端氨基酸为疏水性和芳香族氨基酸时具有较强的ACE抑制效果。蛋白质组分分析发现火麻仁蛋白含有34.60%的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸是制备ACE抑制肽的良好来源。选择虚拟酶切产生较多短肽和生物活性肽的碱性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶对火麻仁蛋白进行定向水解，获得的最终水解液的ACE抑制IC50值分别为1.89和2.30 mg/mL。本研究建立了一种高效精准的制备火麻仁蛋白ACE抑制肽的方法，在降血压药物上具有很好的应用前景。     

ACE抑制肽构效关系研究进展

血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽是一类从食源性蛋白质中分离得到的具有降高血压活性的多肽。由于其降血压效果好,而且没有降压药物的毒副作用从而引起了广泛关注。近年来,ACE抑制肽的构效关系研究成为研究重点。结构生物信息学研究表明,ACE抑制肽的ACE抑制能力不仅与其分子质量有关,而且与其氨基酸序列以及其立体空间构象之间存在高度相关性。ACE抑制肽的抑制类型与ACE抑制活性、构效关系也存在一定相关性。对ACE抑制肽构效关系进行深入研究将有助于指导开发高活性的功能性食品及降血压药物。     

牦牛乳干酪苦味肽ACE抑制活性表征的分子机制

用生物信息学方法计算并分析牦牛乳硬质干酪中鉴定出的3种苦味肽RK7、VN10和SN12的理化特性，对肽结构做能量最小化处理，从PDB数据库获取血管紧张素转化酶(ACE)蛋白晶体的X射线衍射三维结构，通过分子对接和数据库比对评估和表征苦味肽的ACE抑制活性及其与ACE的作用机理。通过计算得出RK7、VN10和SN12的不稳定性指数分别为19.84，49.44和42.87，疏水性分别为42.86%，70.00%和66.67%。分子对接结果表明:ACE分子中的Ala356、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Ser517、Val518、Pro519残基为其与RK7和VN10结合的重要活性位点，RK7、VN10和SN12分别与ACE活性位点的氨基酸形成3，2个和0个氢键；RK7、VN10和SN12与ACE的结合表现出相似的分子机制，均结合于ACE的活性空腔内(X:35.46，Y:43.15，Z:55.47，R:9 ?魡)；RK7、VN10和SN12与BIOPEP数据库中已知ACE抑制肽的最高相似度分别为57.14%，90.00%和75.00%。综合RK7、VN10和SN12与ACE活性位点氨基酸残基相互作用的情况和BIOPEP数据库比对结果预测出3种肽段的ACE抑制活性:VN10 > RK7 > SN12。本试验为理论层面和分子水平研究干酪苦味肽的ACE抑制活性提供参考。     

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明：经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP（－8.44 kcal/mol）和IIVTP（－9.04 kcal/mol）可以抑制ACE活性,半抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L;分子对接结果表明：GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触（3.5 ?范围内）ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。     

Identification of novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from collagen hydrolysates and its molecular inhibitory mechanism

The fish collagen protein was hydrolysed and further fractionated into four molecular weight ranges by ultrafiltration. Subsequently, the peptide fraction with the potent angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity was identified. The potential inhibitory mechanism of the peptide was clarified by molecular docking. As a result, FCPH-Ⅳ with molecular weight between 600 and 1000 Da exerted the high ACE inhibitory activity and was identified by de novo peptide sequencing. The peptide GHVGAAGS exhibited significant ACE inhibitory activity with the IC₅₀ value of 407.28 ± 3.55 μm . In addition, the docking results showed the interactions between the amino acids at the four positions closest to the C-terminal site of GHVGAAGS and the major active residues (GLN281, HIS353, LYS511 and HIS513) of ACE lead to the conformational change in ACE. This work indicates that fish collagen could be utilised to produce ACE inhibitory peptides and develop health products.     

动植物源蛋白体外消化产物结构性质及ACE抑制活性

为揭示动植物源蛋白对于血压调节功能上的差异是否由蛋白肽的血管紧张素转化酶（angiotensin conversion enzyme,ACE）抑制活性所引起,动植物蛋白经体外消化后,对蛋白肽的ACE活性抑制进行研究。采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步消化法,水解植物蛋白（大米、燕麦、大豆、豌豆）、红肉蛋白（猪肉、牛肉）和白肉蛋白（鸡肉）。测定所获蛋白肽的水解度、分子质量分布、氨基酸组成及其ACE抑制率。结果表明,随着蛋白质水解度的增加和分子质量的减小,3类蛋白消化产物的ACE活性抑制率均相应增大。其中,植物蛋白消化产物ACE抑制率最高（60.41%）,红肉蛋白最低（40.13%）。对蛋白质消化产物的氨基酸组成进行分析,结果表明,植物蛋白和白肉蛋白消化产物的疏水性氨基酸含量均显著高于红肉蛋白。3类蛋白中消化产物的疏水性氨基酸含量越高,则ACE抑制活性越高,说明疏水性氨基酸含量高可能是植物蛋白肽具有高的ACE抑制活性的主要原因之一。     

两种血管紧张素转化酶抑制肽作用于靶标的分子机理

采用脱脂乳为原料,利用四步反相高压液相色谱从Lactobacillus helveticus 和Lactobacillus casei subsp. casei制作的酸乳中分离到两种血管紧张素转化酶Ⅰ(angiotensin Ⅰ -converting enzyme,ACE)抑制肽VPP 和IPP,测得它们抑制ACE 活性的IC50 分别为8.89μmol/L 和5.17μmol/L。根据氨基酸序列分析的结果,构建VPP 和IPP 的分子结构,通过分子柔性对接方法研究它们与ACE 相互作用的分子机理,确定它们的作用位点、作用力类型及相互作用能。结果表明：VPP、IPP 和ACE 的活性口袋之间均形成3 个氢键,且存在疏水,亲水等作用力,IPP 与ACE之间的结合较VPP 更稳定,与IPP 比VPP 具有较低的IC50 值的实验结果相一致。     

蛋清中ACE抑制肽的筛选及其作用机制

表征来自卵清蛋白中的血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽。基于在线程序,采用胃肠道蛋白酶对卵清蛋白进行模拟酶切。对获得的三肽毒性、溶解性和ADME性质进行预测,以ACE为蛋白靶标,筛选出能够与ACE紧密结合的三肽,对这些三肽的活性进行验证。结果表明：获得了一种新的ACE抑制三肽CIK,其IC50值为（161±0.06）μmol/L。CIK-ACE复合物通过5 个常规氢键,2 个碳氢键和4 个盐桥达到稳定状态。CIK最佳的对接构型可以与ACE的氨基酸残基Gln281、His353、Ala354、Glu376、Val380、His383、Glu384、Lys511、His513、Tyr523和Phe527形成相互作用。最佳的药效团模型由3 个氢键受体,一个疏水中心和一个正电荷中心组成,三肽CIK可与其中4 个特征相匹配。     

血管紧张素转换酶抑制肽定量构效关系研究进展

在血压调节方面,血管紧张素转换酶（ACE）的活性是重要的影响因子。ACE抑制肽具有抑制ACE活性、降低血压等作用。其毒副作用小、安全性高。该文主要对血压调节机制、ACE抑制肽的降压机理、食源性ACE抑制肽的制备以及定量构效关系进行综述介绍,对指导ACE抑制肽的分子设计过程给予理论分析,有望开发出高活性的功能性食品及降血压药物。     

ACE抑制肽的制备及其结构对活性的影响

血管紧张素转化酶（ACE）通过一系列的生理反应,从而起到升高血压的作用,在人体中过量ACE的产生会引起高血压,而生物活性物质ACE抑制肽能够抑制ACE的功能。文章主要综述了ACE抑制肽的主要制备方法及氨基酸序列特点与ACE抑制活性的关系,并阐述了脯氨酸对ACE抑制活性的影响,以及部分氨基酸的结构特点及功能,为今后ACE抑制肽的制备与应用提供参考依据。     

酸碱处理对酪蛋白源ACE抑制肽稳定性影响的研究

在不同pH值条件下,处理酪蛋白源ACE(血管紧张素转换酶)抑制肽,以ACE抑制活性、游离氨基质量浓度以及色差值为检测指标,研究了酸碱处理对ACE抑制肽稳定性的影响。结果表明,ACE抑制肽受酸碱度影响较大,pH值为1~8的ACE抑制肽的抑制活性维持在一个较高水平,平均抑制活性达到58.33%,pH值为9~13的样品抑制活性明显降低;游离氨基质量浓度在中性条件下较高,随着酸性和碱性条件的增强,其含量逐渐降低;另外,ACE抑制肽在pH<3和pH>11条件下,随酸性和碱性条件的增强,b*值变大,颜色变深。因此,在食品加工贮藏过程中,为使酪蛋白源ACE抑制肽保持活性稳定,应避免其处于过酸或过碱的加工条件。     

α-乳白蛋白源ACE抑制肽快速筛选及验证

采用生物信息学手段，利用在线工具对α-乳白蛋白进行虚拟酶解，通过对活性肽的活性、毒性及理化性质进行预测，并结合分子对接的方法实现快速精准筛选新的血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽Pro-Glu-Trp（PEW）。通过固相合成法制备出活性肽PEW进行体外活性验证，其半抑制浓度（IC50）为3?130?μmol/L。全柔性分子对接模拟结果表明，PEW与ACE活性口袋S1相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因，氢键、疏水作用力、静电力是维持两者结合的主要作用力。与传统方法相比，本研究可以快速高效地筛选出ACE抑制肽，为食源性活性肽的快速筛选提供了新思路。     

Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from wheat gliadin hydrolysate

Angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide was isolated from wheat gliadin hydrolysate prepared with acid protease. Consecutive purification methods were used for peptide isolation including ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography, and reverse-phase high-performance liquid chromatography. The amino acid sequence of this peptide was identified as Ile-Ala-Pro, and the ACE inhibitory activity (IC50 value) was 2.7 microM. The hypotensive activity of Ile-Ala-Pro on spontaneously hypertensive rats was investigated. This peptide inhibited the hypertensive activity of angiotensin I with intravenous injection, and decreased the blood pressure significantly with intraperitoneal administration.