Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(简称TLL)是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。运用RT-PCR技术,从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列,其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。将脂肪酶基因cDNA序列开放阅读框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。诱导表达后SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子量约为32 ku。筛选获得廉价重组菌培养基,表达条件优化结果表明,当OD600约为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在28℃诱导培养7 h,酶活达到41 U/mL。     

重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle产苹果酸乳酸酶发酵条件的优化

该研究以实验室构建的重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle为研究对象,以L-乳酸量为评价指标,通过单因素和正交试 验研究了诱导温度、培养基起始pH值、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间对重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a (+)-mle分泌表达苹果酸乳酸酶（MLE）的影响。 结果表明,重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle分泌表达苹乳酶的最佳培养条件 为培养基起始pH值为5.9,诱导温度为28 ℃,IPTG 浓度0.6 mmol/L,诱导时间3 h。 在此优化条件下,L-乳酸产量为2.37 g/L,较优化前 提高9.48倍。     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

灰产色链霉菌海藻糖合成酶的自诱导表达及两阶段温度控制发酵的优化

克隆灰产色链霉菌海藻糖合成酶基因(tres),导入大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,并对重组菌自诱导发酵条件进行优化。采用简并PCR的方法扩增灰产色链霉菌海藻糖合成酶基因(tres),将tres基因和表达载体p ET28a连接,构建重组质粒p ET28a-tres,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选重组子进行自诱导表达。利用HPLC法测定酶活研究温度对自诱导发酵海藻糖合成酶催化酶活的影响。该研究成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌自诱导表达最优发酵条件:采用两阶段温度控制,37℃培养2.5 h,25℃继续培养14 h,并添加3%乙醇,酶活达到1.29×104U/m L,与传统IPTG恒温培养方式相比酶活提高了55.25%,海藻糖得率达71%。     

乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase的影响

以重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)表达菌株BL21(DE3)作为研究对象,比较IPTG和乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase量的影响,确定优化诱导方式。以Geobacillus CHB1的基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆CGTase基因;利用分子操作技术构建携带有大肠杆菌Omp A信号肽的分泌型表达质粒p EASY-E2-Omp A-CGT,重组质粒热激转化至Escherichia coli BL21中进行表达;在摇瓶发酵条件下,分别以IPTG和乳糖作为诱导剂,通过SDSPAGE分析和测定胞外酶活,确定优化诱导方式。CGTase基因在Escherichia coli BL21中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;乳糖诱导的蛋白表达量优于IPTG诱导,不易形成包涵体;乳糖最佳的诱导起始菌浓度OD600为1.4,诱导浓度、温度分别为0.5%和25℃,分批流加乳糖5次和一次性加入,重组CGTase表达量无明显差异;经初步优化,胞外酶活达19.87 U/m L。Geobacillus CHB1 CGTase基因在大肠杆菌中成功实现胞外表达,乳糖可替代IPTG诱导重组CGTase。     

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15% SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。     

N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因在大肠杆菌中的高效表达

以大肠杆菌TG1的染色体总DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以p ET28(b)构建的nanA基因重组质粒p ET28(b)-nanA转化大肠杆菌BL21(DE3),达到高产N-乙酰神经氨酸醛缩酶的目的。在得到的转化子大肠杆菌BL21(DE3)/pNA1中,nanA基因受lac启动子控制,为IPTG或乳糖所诱导表达。此工程菌产酶量在浓缩后达到6.13mg/m L。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

产脂肪酶重组菌SRI-01随机突变及诱导表达条件的研究

采用大引物全质粒法（MEGAWHOP）随机突变,快速有效地对研究室前期构建的一株脂肪酶重组菌株SRI-01进行分子改造,通过对易错聚合酶链反应（ep-PCR）获得的2 300个突变株进行96孔板高通量筛选,得到一株优良突变株SRM08。通过单因素试验,优化诱导前的菌体生物量、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的浓度、CaCl2的浓度、诱导温度。通过比较3种不同破碎缓冲液浓度和缓冲液pH对脂肪酶活力的影响,选择最优的破碎缓冲液。确定突变株SRM08最佳诱导表达条件为菌液生物量OD600 nm值为0.7,IPTG的浓度为0.1 mmol/L,CaCl2浓度为4 mmol/L,诱导温度为25 ℃,采用5 mmol/L磷酸钠缓冲液为破碎缓冲液,pH值为7.0。在此优化条件下,脂肪酶活达到88 508 U/L,为原重组菌株SRI-01的2.84倍。     

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。     

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coliBL21（DE3）/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓（OD600 nm）达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95 μL＋2.5 g/L乳糖,25 ℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。     

细菌透明质酸酶基因工程菌的构建及高效表达

目的将兽疫链球菌透明质酸酶hyl基因在大肠杆菌原核表达系统中高效分泌表达。方法通过PCR方法扩增得兽疫链球菌hyl基因,Xho I和Nco I双酶切后,连入表达载体pET26b(+),并转化入大肠杆菌,经低温异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖诱导表达,DNS法检测胞外透明质酸酶活性。结果成功构建含兽疫链球菌透明质酸酶基因hyl的大肠杆菌基因工程菌株,经IPTG诱导并添加甘氨酸后胞外透明质酸酶活性高达5.3×104 U/mL。结论实现了透明质酸酶在原核系统中的表达,为工业化生产奠定了基础,具有很好的市场前景。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。