普通烟草WDR基因的克隆与序列分析

在烟草腺毛的发育中,WD40-bHLH-MYB复合体起着重要的调控作用。利用RT-PCR从云烟85中克隆得到一条普通烟草(Nicotiana tobacum)WDR(NtWDR)全长cDNA序列,GeneBank登录号为GQ260131。NtWDR基因cDNA全长1433bp,具有一个1029bp的开放阅读框(ORF)、一个147bp的5′非翻译区和一个257bp的3′非翻译区。该基因编码一个342aa的蛋白质,预测的分子量为38.49kDa,等电点为4.81。BLASTs和NCBI保守域收索表明,NtWDR是AN11/TTG1型WD40蛋白。系统进化和结构特征分析表明,NtWDR基因是PhAN11和Le113964R基因的垂直同源基因。     

甜杏仁和苦杏仁野黑樱苷水解酶基因的克隆

以轮台小白杏（甜杏仁品种）和甲麦黄杏（苦杏仁品种）为实验材料,采用同源基因克隆方法克隆野黑樱苷水解酶（prunasin hydrolase,PH）基因。轮台小白杏PH基因命名为PaLTPh（GenBank登录号：KF888615）,序列长度3 686 bp;甲麦黄杏PH基因命名为PaMJPh（KF888616）,序列长度3 690 bp。PaLTPh和PaMJPh与扁桃Ph691基因相似性为94%。根据PaLTPh和PaMJPh保守区序列设计引物,克隆编码区（coding sequence,CDS）序列。PaLTPh CDS（KF888617）和PaMJPh CDS（KF888618）序列长度均为1 635 bp,与扁桃Ph691全CDS区相似性为97%。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均为全长的开放阅读框,编码蛋白质长度为544 个氨基酸。PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含长度为26 个氨基酸的信号肽和糖基水解酶家族Ⅰ结构域,可催化野黑樱苷水解为扁桃腈和葡萄糖。杏PH基因与扁桃Ph691具有高度的同源性。     

烟草糖基转移酶基因NtGT5a的克隆及原核表达

为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41。通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15Ⅲ下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白。重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在。将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

烟草叶片表面抗性蛋白T-phylloplanin基因的克隆

从烟草突变体T-cldf叶片表达基因的SSH文库中,筛选到一个与真茵抗性相关的表达序列标签P1T10(GenBank Access No.EBl02896).以P1T10序列为模板设计引物,用末端快速扩增(RACE)技术扩增得到T-Phylloplanin的cDNA全长(GenBank Access No.DQ451214).利用DNA STAR软件的EditSeq程序(Version 5.01)分析T-Phylloplanin基因,显示它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有110个氨基酸、等电点为7.74、分子量为11.3 kD的小分子量蛋白(GenBank Access No.ABE03627).通过BLAST比对发现它与烟草叶片的一个表面抗性蛋白全长基因(GenBank Access No.AY705384)的同源性为93%.通过半定量RT-PCR分析表明,T-Phylloplanin在烟草突变体T-cldf叶片中的表达量高于烟草K346.     

烟夜蛾感觉神经元膜蛋白基因的克隆、序列分析与组织特异性表达

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guenée)触角中扩增得到感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因HassSNMP(GenBank登录号:EU580138)。序列分析结果显示,该片段长度为1658bp,其中ORF长1572bp,编码523个氨基酸残基,预测成熟蛋白分子量为59.2 kDa,等电点为6.54。序列比对结果表明,烟夜蛾与其它昆虫的SNMP基因推导表达的氨基酸序列具有较高的一致性。半定量RT-PCR研究结果显示,SNMP在烟夜蛾触角、头(去掉触角)、喙和足中表达,其中在触角中的表达量最高,且雌雄虫触角中的表达量差异不显著,在喙中的表达量次之,在翅、胸和腹中没有表达;此外,该基因在成虫、十日龄蛹以及卵中也有表达,其中在卵中的表达量相对较低;在幼虫、一日龄蛹、四日龄蛹和七日龄蛹中没有表达。该研究结果说明烟夜蛾SNMP是非触角特异性表达基因。     

蒜头果中3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与表达分析

以蒜头果(Malania oleifera)为实验材料,基于转录组数据分析,采用RT-PCR方法获得蒜头果3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因的cDNA序列,命名为MoKCS1,GenBank登录号为MK210592。序列分析显示MoKCS1基因cDNA全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,属于KCS家族。序列比对分析显示Mo KCS1拥有KCS家族特有的3个功能保守结构域,与榴莲(Durio zibethinus) KCS的蛋白序列同源性为80. 66%;与已知超长链KCS蛋白进行系统进化分析显示,MoKCS1独立形成一个分支。荧光定量PCR分析表明,MoKCS1在蒜头果果实膨大期的表达量最高,而在叶中几乎不表达。     

一株黑曲霉creA基因的克隆与序列分析

本研究从一株产生淀粉糖化酶的黑曲霉中克隆到了碳源代谢阻遏因子creA基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该creA基因的DNA和cDNA序列编码区长度均为1 284 bp,这说明该基因不含内含子,共编码427个氨基酸,氨基酸序列中共含有1个潜在的糖基化位点,软件预测出creA基因编码的蛋白分子量约为48 kDa,等电点为9.6。该研究为今后研究黑曲霉生淀粉糖化酶的产酶调控机理奠定了基础。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

烟草类胡萝卜素降解关键基因CCD1的克隆与表达分析

烟草类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前体物,利用RACE方法获得了烟草品种K326类胡萝卜素降解关键基因CCD1的2个cDNA全长序列。序列分析表明,CCD1-1与CCD1-2各包含一个1635和1647bp的开放读码框(ORF),编码544和548个氨基酸。分别与林烟草和绒毛状烟草CCD1存在一个碱基的差异。CCD1-1与CCD1-2基因序列GC含量为43.24%和42.87％。预测的蛋白质分子量均为61 kDa, 理论等电点 (pI) 6.51和6.55。与番茄和辣椒等植物的类胡萝卜素CCD1的同源性达到80％以上。跨膜区预测表明分别在138～158和142~162位氨基酸间有1个跨膜螺旋区。蛋白质二级结构分析表明,均以β折叠和无规则卷曲为主。蛋白三维结构预测分析表明CCD1-1与CCD1-2空间结构极为相似。组织表达分析表明,CCD1-1与CCD1-2在花中的表达最强,根中的表达最弱,茎和叶次之。这些结果为进一步研究类胡萝卜素降解基因的功能提供了依据。      

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与序列分析

为揭示类胡萝卜素双加氧裂解酶基因(CCDs)在烟草生长发育过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆到烟草的类胡萝卜素双加氧裂解酶4基因(NtCCD4),编码区1806 bp,编码601个氨基酸,基因序列提交NCBI,GenBank登录号为JF947192.根据氨基酸组成对NtCCD4基因编码蛋白的疏水性/亲水性、蛋白结构及进化关系等进行预测和分析.结果表明:烟草NtCCD4基因编码的蛋白分子量为65936.3 Da,等电点为6.58,定位在叶绿体膜上,为一个稳定的亲水性蛋白;二级结构预测显示此蛋白结构以无规则卷曲(57.4％)为主,α螺旋(13.31％)和β转角(6.61％)所占比例相对较少;进化分析表明NtCCD4是类胡萝卜素双加氧裂解酶基因( CCDs)家族中的一个成员,与其他物种的CCD4蛋白比较显示NtCCD4编码的蛋白含有多个保守区域,其中4个组氨酸残基是组成蛋白功能域所必须的,它们与Fe2+结合共同组成蛋白酶的活性中心.     

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

双孢蘑菇中一种4R型MYB转录因子的基因克隆和生物信息学分析

MYB转录因子广泛存在于真核生物中,在植物的生长发育、逆境胁迫等过程中发挥重要作用。与植物相比,对食用菌中MYB转录因子的研究有限。为探究MYB转录因子在食用菌中的生物学功能,对前期转录组发现的一个编码双孢蘑菇（Agaricus bisporus）MYB转录因子的基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长1 209 bp,翻译402个氨基酸;编码的蛋白分子量为45.95 kDa,等电点9.17,是一种不存在跨膜结构、不含信号肽的亲水性蛋白,具有4个高度保守的SANT结构域,属于4R型MYB转录因子,与白环蘑（Leucoagaricus）中的4RMYB转录因子亲缘关系最近;二级结构预测显示以无规则卷曲和α-螺旋结构为主;亚细胞定位分析显示该转录因子位于细胞核中;此外启动子序列分析表明,该基因启动子区域含有多个与生物抗逆应答、激素响应等相关的顺式作用元件。     

花生中UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-葡萄糖基转移酶的基因,命名为AhUGT83A1-like（GenBank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。