多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

枯草芽孢杆菌胞外多糖的快速测定与发酵条件优化

枯草芽孢杆菌B1⑥菌株能产生大量胞外多糖,并且,随着多糖含量的提高,发酵液黏性也随之增加,而测定多糖黏度比测定多糖的含量方法简便、快速,对于生产实践具有一定的指导意义。通过实验,建立了多糖含量与发酵上清液黏度的关系模型,结果显示胞外多糖含量与发酵上清液黏度在一定程度上呈正相关性。应用该模型于胞外多糖发酵条件的优化,筛选出了培养基的最佳碳源、氮源及C/N。经过4因素3水平的正交实验,筛选出的最优发酵方案是:蔗糖3%,硫酸铵1%,(C/N=3/1),Mg-SO4 0.05%,Na2HPO4 0.2%,NaH2PO4 0.1%,CaCl2 0.1%,MnSO4 0￣0.1%,接种量10%￣12%,pH7￣7.5。同时检验了该模型的实用性,测量黏度简单方便,一定程度上可以指导生产实践。     

GGE双标图在烤烟新品种重要经济性状筛选布局中的初步应用

为深入研究和评价烤烟新品种的丰产性、稳定性和品种生态布局,通过引入新型分析工具GGE模型,对2011年中间香型烟叶产区7个试点、11个烤烟新品种（系）的产量和产值进行了直观比较分析。结果表明,GGE双标图解释了产量总变异的71．9％和产值总变异的64．4％,具有真实代表性。GGE双标图显示,参试材料间丰产和稳产性差异很大,有些材料对某些环境具有特殊适应性。11个新品种（系）中,毕纳1号和贵烟1号总体表现为丰产、稳定和广适,同时毕纳1号、秦烟98和HB032分别为区1（遵义、武隆、桑植）、区2（旬阳、蒙阴）和区3（贵定、成丰）的丰产新品种（系）。这为中间香型烟叶产区烤烟新品种的筛选和评价提供了借鉴。     

红曲桔霉素致毒机理的网络药理学分析

为探讨红曲中桔霉素导致毒性的内在机理,通过搜索Swiss Target Prediction、Similarity ensemble approach、Comparative Toxicogenomics Database和GeneCards数据库,利用Metascape、Kobas 3.0、Cytoscape 3.7.2和AutoDock软件,开展了网络药理学分析。结果显示,通过筛选去重获得桔霉素与“liver toxicity”和“kidney toxicity”相关的潜在靶点110个,GO 富集分析功能条目496条,其中涉及分子功能、生物过程和细胞组成的条目分别为97、354和45条。KEGG信号通路富集靶点数和显著性均较高的是肿瘤MicroRNA通路、肿瘤通路、乙型肝炎等通路。桔霉素可能通过TP53、CASP3、MAPK3和ALB等关键靶点导致肝肾毒性。分子对接实验证明,桔霉素与靶点可以结合,揭示了桔霉素导致肝肾毒性的潜在作用靶点和信号通路,为进一步研究桔霉素致毒机理和健康防护提供理论参考。     

烟草糖基转移酶基因NtGT5a的克隆及原核表达

为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41。通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15Ⅲ下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白。重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在。将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白。     

曾纪泽的国际法认识与实践初论

中国早期驻外公使之一的曾纪泽通过对近代国际法的深刻认识与理解，运用国际法与西方国家进行外交事务上的交涉和谈判，虽然在本质上不能改变晚清政府外交上的弱势地位，但还是在一定程度上维护了国家和民族的权益。     

烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。     

烟叶DNA甲基化特征与化学成分的相关性

为明确烟叶DNA甲基化的特征与化学成分的关系,利用烤烟DNA甲基化DArT芯片,分析了K326、红花大金元(红大)和遵烟6号在贵定和兴义两个试点,3个部位烟叶在不同发育时期的DNA甲基化特征和化学成分含量。结果显示,烤烟DNA甲基化水平变异较高,最高为64%,最低为35.4%,平均为47.61%,变幅为28.6%。品种间的甲基化模式差异最大,其次是生长部位。DNA甲基化水平与12种物质代谢关键酶活性和76种致香成分的相关分析发现,DNA甲基化与这些酶活性和化学成分呈极显著相关(p0.01),在3个品种中同步呈现极显著相关(p0.0001)的酶及化学成分有34个,不同品种中也呈现出受特异性调控的化学物质。     

烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略

通过检索国内外近10年烟草转基因研究的相关文献,建立了转基因烟草常用转化遗传元件的数据库,统计了每个遗传元件及组合元件的使用频率后,发现利用7种遗传元件,包括:启动子P-35S、标记基因NPT II、HPT、Bar和aadA、报告基因GUS及终止子T-NOS作为靶标元件组合,能使目前烟草转基因事件的理论筛查率达到100%,从而构建出转基因烟草的优化筛查策略,为行业转基因烟草检测提供依据。      

中间香型烟叶特色彰显度与主要化学成分的相关及通径分析

为了解中间香型烟叶特色彰显度与烟叶主要化学成分的关系,对国内不同中间香型产区烟叶主要化学成分及派生值与中间香型特色彰显度进行了简单相关和通径分析.结果表明,烟碱和钾氯比与中间香型特色彰显度呈极显著或显著正相关;两糖比、蛋白质、氮碱比、氯、总氮和糖碱比与中间香型特色彰显度呈极显著或显著负相关.通径分析表明,烟碱、总氮、氯、蛋白质和糖碱比直接影响中间香型特色彰显度,两糖比主要间接影响中间香型特色彰显度,氮碱比和钾氯比对中间香型特色彰显度的影响间接效应大于直接效应.