AB SCIEX TripleTOF 5600在蛋白质组学研究中的应用

AB SCIEX公司最新发布全新的高分辨液相色谱质谱联用系统——TripleTOF5600是在享有盛名的API 5500三重四极杆系统和QSTAR Elite(QqTOF)系统这两个技术平台的基础上开发出来的。TripleTOF 5600高分辨液相色谱质谱联用系统能够对复杂的蛋白质组学样品进行高通量分析,并能同时提供高质量的定性和定量结果。为评估这款仪器的性能,设计基于纳升液相色谱和TripleTOF 5600联用系统的一系列实验。首先,应用这一拥有高分辨率、高灵敏度和高质量准确度的系统对酵母细胞裂解物的胰酶消化产物进行分析。实验中采用每秒最多采集50幅串联质谱谱图的信息相关采集模式,单次LC-MS/MS实验就鉴定10179条独特肽段和1174种蛋白(at 1%global false discoveryrate)。而实际达到平均每秒34幅串联谱图的采集速度是在单次实验获得如此优异的鉴定结果的决定性因素。此外,也对一组含有5种已知蛋白以及部分重同位素标记肽段的样品进行分析,以检验TripleTOF 5600的定量能力。实验中这5种蛋白质都获得很高的序列覆盖率,其中进样量仅有100amol的Peroxiredoxin 1蛋白的序列覆盖率也高达53%。而测试中得到肽段的平均质量偏差仅为1.7 ppm,展示TripleTOF 5600的高质量准确度和稳定性。此外还获得高度准确的定量结果,充分证明TripleTOF 5600能够提供三重四极杆系统级别的定量结果。     

人唾液蛋白质组的纳升液相色谱-高分辨串联质谱鉴定及高丰度蛋白质分析

常规的定性分析质谱数据能否以及如何应用于蛋白质组学的相对定量分析是实际工作中经常遇到的问题。本研究采用一维纳升液相色谱-高分辨串联质谱（nano-HPLC-Triple TOF 5600）法鉴定人唾液蛋白质组,并分析其基本组成,以探讨质谱数据与唾液中高丰度蛋白质的相关性。本实验共鉴定了6044条特异性酶切肽段,归属于α-淀粉酶1、碳酸酐酶6、血清白蛋白、粘蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白等各种已知的高丰度蛋白质在内的521个蛋白,这为一维纳升液相色谱分离条件下的唾液蛋白质组的基本组成分析提供了参考。结果表明,仅用蛋白质排序指标Unused值表征蛋白质的相对含量具有局限性,而蛋白质排序、检出肽段数目和肽段平均强度等综合指标与蛋白质相对含量具有正相关性,即排名较后的蛋白质均只有1条肽段被检出,且肽段强度较低。这说明,当蛋白质相对含量差别较大时,肽段的化学性质和电离效率差异对质谱信号的影响已不占主要地位,即可以认为当肽段检出数目、鉴定覆盖率和肽段强度均较低时,蛋白质的相对含量也较低。该结果可为利用Triple TOF 5600质谱仪的定性鉴定数据进行初步半定量判断提供参考,也可为唾液蛋白质组生物标志物研究提供借鉴。     

下一代主力液质联用仪——AB SC IEX 4500系统

AB SCIEX公司在2012年美国PITTCON会议上推出下一代主力液相色谱质谱联用系统4500系列,为常规定量和筛查分析设定了新标杆。AB SCIEX Triple Quad 4500系统是一款新型的三重四极杆质谱仪,相比市场上竞争的其它三重四极杆质谱仪,该系统灵敏度提高了10倍。AB SCIEX 4500系统同样具备QTRAP技术,集定性和定量功能于一体。专利QTRAP技术结合业界灵敏度最高的线性加速离子阱,使得灵敏度相比同档次的三重四极杆质谱提高了100倍。     

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。     

四极杆离子光学和串联振荡电子学系统

四极杆和飞行时间质谱是液相色谱-质谱（LC/MS）、三重四极杆质谱（QQQ）和四极杆-飞行时间质谱（Q TOF）等质谱仪器中必备的核心部件，也是我国亟待研发的国产化仪器。目前，国内对质谱仪器的研制热情日益高涨，得到了国家相关部门的高度认可和广大研发人员的积极响应。本综述基于作者课题组多年的研制经验，从质谱仪器研发的角度介绍实现离子光学系统和电子学系统的技术原理。首先回顾四极杆的基本原理；然后着重讨论加工和装配精度对提高四极杆分辨率的重要性，以及四极杆尺寸选择对射频电压控制的影响；最后重点介绍四极杆串联振荡电子学系统以及在系统中起关键作用的阻抗匹配，希望能为质谱仪器研制提供参考。     

甲胎蛋白纯品的同位素稀释质谱法测定

建立了基于特征肽段的甲胎蛋白的液相色谱-同位素稀释串联质谱检测方法。选取3条同位素标记的甲胎蛋白特征肽段作为内标,准确称其质量后与酶切后的甲胎蛋白样品定量混合,采取Phenomenex Kinetex 2.6 μm C18色谱柱分离,电喷雾三重四极杆串联质谱多反应监测模式（MRM）测定,并对最优酶切条件、酶切效率以及定值结果的不确定度进行了考察和评定,得到的甲胎蛋白标准物质的最终测量结果为（0.329±0.016）mg/g。     

液质联用技术中不同蛋白质鉴定策略的比较

在常用的多维液相色谱-质谱联用技术中,采取延长梯度洗脱时间、进行重复实验、采用质谱分段扫描等多种方法,提高对蛋白质的鉴定效率。为了系统评价这些方法在复杂生物样本分析中的效果,应用酵母的蛋白提取物作为样本,在LCQ质谱仪上进行一系列的比较实验。结果表明,在一定范围内,随着梯度时间的延长,被鉴定的非冗余肽段（unique peptide）数量显著增加,相对应的蛋白质簇（group protein）数量也随之增加。同样,进行重复实验和采用质谱分段扫描的方法均能提高蛋白鉴定的覆盖率,而采用质谱分段扫描的策略具有更为显著的效果,因此在规模化蛋白质组分析中,应当选择更为合适的、互补的研究策略以提高结果的完整性。     

中药成分质谱分析新技术和新策略进展

中药是一个复杂的分子系统。如何全面、高效地分析中药成分是中药研究的难点。质谱分析技术，尤其是超高效/超高压液相色谱与高分辨质谱联用，具有高选择性、高灵敏和高质量精度的特点，是中药成分分析的有力手段。近年来，多功能杂化质谱带来的质谱数据采集新技术和数据处理新策略也在不断发展，如全信息串联质谱（MSE）技术、SWATH技术、质谱树状图相似度过滤技术（MTSF）和分子网络策略（MN）等，加快了中药成分分析过程。本文综述了质谱分析新技术和新策略在中药成分分析中的应用，包括色谱-质谱联用和离子淌度技术，以及质谱参数设置、采集模式和数据处理策略，并对其前景进行展望。     

赛默飞推出仪器控制软件——用于实现蛋白质组学数据独立采集的组合式质谱仪

9月28日,赛默飞世尔科技推出用于Thermo Scientific Q Exactive高性能四极杆一轨道阱LC—MS／MS的全新数据独立采集（DIA）蛋白质组学功能。新型DIA功能使QExactivew质谱仪选择宽广的m／z窗口并在该窗口中裂解所有母体,从而采集样品中所有离子的MS／MS谱图,使仪器能够在单次运行中对样品中几乎所有已检测的肽段进行定量。     

赛默飞推出用于组合式质谱仪的仪器控制软件

近日,赛默飞世尔科技推出用于Thermo Scientific Q Exactive高性能四极杆-轨道阱LC—MS／MS的全新数据独立采集（DIA）蛋白质组学功能。新型DIA功能使QExactive质谱仪选择宽广的m／z窗口并在该窗口中裂解所有母体,从而采集样品中所有离子的MS／MS谱图,使仪器能够在单次运行中对样品中几乎所有已检测的肽段进行定量。     

创新的蛋白质组学质谱应用新技术——SWATH技术

AB SCIEX公司在2011年美国第59届质谱年会上新推出了SWATH（Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions,SWATH）采集技术,该技术是与苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold博士及其团队共同开发的。SWATH采集模式为研究蛋白质组学的用户带来了创新的技术,科学家利用该技术可以在一次进样分析中即可获得复杂蛋白质组样品中每个肽段的数据。SWATH采集模式是AB SCIEX的MS/MSALL技术的延伸,此功能只能在TripleTOFTM5600系统上完成,作为对MRMAtlas的完美补充,为未来蛋白质组学研究提供了一种全新的工作流程,预计将产生令人震撼的蛋白质组学新发现。     

基于质谱的蛋白质绝对定量研究策略和建议

科学家已经研究获得了大量的蛋白质/多肽潜在生物标志物,这些生物标志物需要经过验证和确证才能进一步转化到临床应用。针对蛋白质/多肽的绝对定量研究在标志物验证和确证过程中起到关键作用。传统的蛋白质定量方法,如酶联免疫吸附试验（ELISA）技术存在蛋白质抗体难以获得、不同抗体批次之间存在差异、基于抗体的检测存在交叉反应等问题。近年来,随着质谱仪器性能的提升,质谱法已经广泛应用于蛋白质大分子以及代谢物小分子定量研究领域,基于质谱法的蛋白质/多肽定量方法也得到发展,其中靶向蛋白质组学技术,如SRM/MRM、PRM和MRM3技术结合标准品可对目标蛋白质/多肽进行精确多重定量。因此,基于靶向质谱法的蛋白质/肽段绝对定量的策略应运而生。根据标准品不同,质谱绝对定量方法包括基于合成肽段、基于合成完整蛋白以及基于标记试剂。本文详细介绍了基于质谱法的蛋白质/多肽绝对定量策略的研究进展,对比各种策略的优势和限制,总结其在生物医学研究领域的应用。同时,还总结了目前蛋白质绝对定量面临的挑战,并根据已有研究报道对提高定量的精确度,促进蛋白质/多肽定量技术向临床转化提出建议,包括对标准品肽段的选择、处理、储存,标准曲线的建立,以及对整个流程严格的质控方法。     

GC-MS/MS方法测定大米中农药残留杀虫环

目前测定大米中杀虫环的农药残留多采用气相色谱方法,样品前处理时试剂需要提纯,既危险又繁琐,目标峰还存在干扰,影响定性;采用液相色谱和液质联用的方法处理样品需使用固相萃取柱,增加了检测成本,也比较费时间,液质联用方法虽然定性比较准确,但其检出限比较高。本文采用溶剂萃取方法处理样品,气质质联用仪测定,样品处理简单,耗材成本低。本方法对仪器条件进行了优化,具有较好的重复性和较低的检出限。测定重复性的标准偏差(RSD)达到4.1%,检出限达到0.8μg/kg,由于本方法较低的检出限,对研究大米中农残杀虫环的降解过程将提供有力的检测手段。     

血浆代谢组同时定性定量分析方法研究

数据非依赖的质谱采集是近年来发展的一种新型多级质谱分析方法，只需一次进样便可同时快速获取所有母离子及其子离子信息。本研究以肺癌血浆样本为研究对象，采用数据非依赖的SWATH（sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）采集技术，建立了液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）同时定性定量分析血浆代谢组。基于代谢物数据库识别比对，成功识别了93个代谢物，实现了代谢物的定性分析。对成功识别的代谢物建立定量分析方法并进行方法学考察。结果表明，其中90个代谢物的线性相关系数大于0.99，定量限在1.25~12 000 μg/L之间；其中有86个代谢物可以满足生物样本定量分析的要求，其连续4天的日内精密度和日间精密度均小于20%；在4 ℃下，96 h内的放置稳定性在0.62%~19.35%之间。该方法的覆盖率高，能同时快速准确地对肺癌血浆中癌症相关代谢物进行定性定量分析，也适用于其他生物样品，可以为定量代谢组学分析提供重要的方法学平台。     

LC-MS/MS法定量测定人血浆中CPRC-127血药浓度

A sensitive liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS) method for the determination of CPRC-127 in human plasma was developed and validated. The plasma was extracted using a liquid-liquid phase extraction(LLE), and the sample extract was injected onto the LC-MS/MS system. The limit of quantitation(LLOQ) for CPRC-127 is 0.5 μg•L^－1. This method allows the reproducible and accurate quantification with the concentration range of 0.5-1 000 μg•L^－1. This method can be applied to the quantitation of CPRC-127 in human plasma.     

AB SCIEX离子淌度差分质谱技术SelexION~（TM）——极限提高质谱鉴别能力

AB SCIEX公司2011年最新推出了SelexIONTM技术。该技术解决了现有同类型仪器设计的不足,保留了串联质谱所有的功能,是首个获得高重现性、耐用性及易用性的离子淌度差分质谱分离技术（Differential Mobility Spectrometry,DMS）,同时还可为高灵敏度的定量与定性分析提供更多一维的选择性。DMS系统应用于Triple QuadTM5500和QTRAPTM5500系统,开创了分析选择性和效率的新纪元,适用于同分异构体样品分析、共流出杂质分离以及消除高背景噪音。     

HPLC-MS/MS法同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度

建立高效液相色谱 串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时测定人血浆中替米沙坦和氢氯噻嗪的浓度。选用Zorbax Eclipse XDB-C 18色谱柱,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵为流动相,采用梯度洗脱进行分离,样品用V（乙醚）∶V（二氯甲烷）=60∶40的溶液,液-液萃取后进样,选用3200Q-Trap型质谱仪的多重反应监测（MRM）扫描方式进行检测。替米沙坦线性范围为1.0~1 000.0 μg/L,氢氯噻嗪线性范围为0.6~200.0 μg/L,定量下限分别为1.0和0.6 μg/L。准确度与精密度结果显示,方法日间、日内变异均小于15%,相对偏差分别为替米沙坦-5.6%~4.3%、氢氯噻嗪-6.3%~2.7%。替米沙坦和氢氯噻嗪的低、中、高3个浓度提取回收率均大于50%,稳定性较好。该方法可用于人体替米沙坦和氢氯噻嗪血药浓度的同时监测,以及复方制剂的人体药代动力学研究。