基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法进行肌红蛋白的从头测序

蛋白质的序列测定对于蛋白质的鉴定具有重要意义.传统的Edman降解测序法对样品纯度有很高的要求,而且操作比较繁琐.在蛋白质组研究中广泛采用串联质谱法测定蛋白质水解肽段的部分氨基酸序列(肽序列标签),通过数据库检索来鉴定蛋白质[1,2].本工作采用反相色谱法分离肌红蛋白的酶切肽段,用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOFMS)技术测定各个肽段的氨基酸序列,拟提高蛋白质的序列覆盖率和鉴定的可靠性.     

液质联用技术中不同蛋白质鉴定策略的比较

在常用的多维液相色谱-质谱联用技术中,采取延长梯度洗脱时间、进行重复实验、采用质谱分段扫描等多种方法,提高对蛋白质的鉴定效率。为了系统评价这些方法在复杂生物样本分析中的效果,应用酵母的蛋白提取物作为样本,在LCQ质谱仪上进行一系列的比较实验。结果表明,在一定范围内,随着梯度时间的延长,被鉴定的非冗余肽段（unique peptide）数量显著增加,相对应的蛋白质簇（group protein）数量也随之增加。同样,进行重复实验和采用质谱分段扫描的方法均能提高蛋白鉴定的覆盖率,而采用质谱分段扫描的策略具有更为显著的效果,因此在规模化蛋白质组分析中,应当选择更为合适的、互补的研究策略以提高结果的完整性。     

用疏水色谱法纯化基因重组 牛朊病毒正常成熟蛋白

研究并比较了高效疏水相互作用色谱（HPHIC）的流动相组成、固定相、pH值和梯度方式对分离基因重组大肠杆菌高效表达的牛朊病毒正常成熟蛋白的影响,在此基础上,确定了牛朊病毒正常成熟蛋白分离纯化的最优化条件,即仅用高效疏水色谱法坦 步便可得到纯度和质量回收率均大于90%的目标蛋白,还讨论了用HPHIC对变性bPrP^cL的分离机理。     

质谱多反应监测技术（MRM）及其在蛋白质细胞器定位与定量研究中的应用

肝脏中的蛋白质只有处于特定的亚细胞中才能发挥其功能。研究特定蛋白质的亚细胞定位对于肝脏功能研究有重要意义[1]。对于多定位的蛋白质,确定其在不同细胞器中量的变化,也是肝脏蛋白表达谱研究的重要内容之一。目前,蛋白亚细胞定位分析方法主要包括实验方法和理论预测方法两大类。其中实验方法主要有绿色荧光蛋白（GFP）-激光共聚焦显微镜法、免疫电镜胶体金标记法、差速离心-免疫印迹法等。理论预测方法主要根据蛋白质的氨基酸组成、氨基酸对组成以及位置特异性打分矩阵等分类特征,采用模糊k近邻、支持向量机及分组重量编码法等方法进行理论预测。实验方法不仅分析通量低,还需要特异的抗体,并且在定位的同时难以实现定量分析。对于不同的理论预测方法而言,往往会得出不同的结论,准确度差。因而需要建立一种可以实现通量化、准确地进行蛋白亚细胞定位及定量分析的方法。 近年来,质谱多反应监测技术（MRM）在蛋白质定量分析方面的应用越来越广泛^[2]。该技术通过特异性的检测预先设置的母离子和子离子,在母离子和子离子两个水平排除其它离子的检测干扰, 从而增强检测的特异性。同时结合同位素稀释技术可以同时实现对多种目标蛋白质的绝对定量。由于该技术采用特异性检测预设的母子离子对的方法,从而保证了检测的重现性。而依据特定子离子和相应的同位素标记子离子对峰面积进行绝对定量的方法保证了定量的可靠性。同时可以批量化同时进行多个蛋白质的亚细胞定量及定位分析。因而本研究利用MRM技术,用于目标蛋白在肝脏细胞器中定位及定量分析研究。 鉴于本研究样品采用蔗糖密度梯度离心法制备,首先对细胞器样品的分离效果进行评价。选用文献报道^[3]的正向和反向免疫评价抗体蛋白,包括线粒体Marker蛋白COX4、VDAC和Cytc,细胞核Marker蛋白Lamin B,质膜Marker蛋白Na＋K＋-ATPase等。利用MRM技术分析蛋白在不同细胞器样品中的含量,从而对细胞器样品纯度进行评价。同时考察方法的灵敏度,重现性以及动态范围。 在确定了细胞器样品纯度的基础上,利用MRM质谱技术对选定的部分目标蛋白进行了定位分析。根据这些蛋白在不同细胞器样品中的含量,判断其在不同细胞器样品中的定位。并选择其中一些蛋白进行GFP-激光共聚焦显微镜分析,与基于MRM技术的定位分析结果进行对比验证。     

基于质谱多反应监测技术（MRM）的蛋白质定量策略及其在肝癌生物标志物研究中的应用

肝癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤,在中国占癌症死亡率的第二位,年死亡率约为20.37/10万^[1]。肝癌的早期发现是提高疗效延长患者生存时间的关键。寻找和研究特异性强、灵敏度高的肝癌生物标志物蛋白质作为肝癌的早期诊断或预警对于改善肝癌早期诊断率低的状况尤为重要。近几年来,基于质谱技术的蛋白质组学发展加快了生物标志物的研究进程^[2]。采用差异蛋白质组技术,通过比较健康和疾病状况下的蛋白质表达量变化,能获得大量与肝癌发生、发展相关的生物标志物候选蛋白质。然而,从这些候选蛋白质列表中,筛选与疾病发生发展更为密切的生物标志物,确证其在临床检测中的特异性和灵敏度却成为目前生物标志物研究流程中的瓶颈^[3]。传统的生物标志物确证的主要方法是基于免疫学原理的Western-blot和ELISA,由于特异性抗体获取困难制备周期长,使大量生物标志物候选蛋白质确证工作受到限制^[4]。而发展基于质谱MRM技术的蛋白质生物标志物候选蛋白质的定量验证策略,不需要进行特异性抗体的合成,为解决验证工作的瓶颈提供了一种新思路^[5]。 Vitronectin蛋白和clusterin蛋白在各种恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用,并且也有研究报道认为这两种蛋白质在血清中的表达水平与肝功能受损密切相关。在本研究中,通过采用18O稳定同位素标记方法合成肽段内标并结合MRM质谱检测技术,建立了一种方便快捷的蛋白质绝对定量方法并用于以上两种生物标志物候选蛋白质在肝癌血清中的定量确证。首先针对血清样品干扰组分多和动态范围宽的特点,优化质谱MRM检测条件,引入丙酮沉淀技术改善样品预处理步骤,设计优化的液相色谱分离条件,最终满足了多个血清样本的高通量测定要求。然后,考察了定量方法的可靠性,包括特异性、精密度、准确度、预处理回收率、测定重复性以及定量线性。方法学验证结果显示,在0.4~40 fmol•µL^－1的浓度变化范围内定量测定线性相关性良好,r2值大于0.99。蛋白质最低定量限为0.4 fmol•µL^－1。精密度RSD＜11.96%,准确度RE%＜20%。预处理回收率大于87%,测定重复性RSD＜6.87%。最后,采用建立的方法进行了20例临床血清样本的检测,其中10例健康血清,10例肝癌血清。两组定量数据的统计分析采用非参数统计方法Mann-Whitney检验。在血清样品中测定的vitronectin 和clusterin浓度变化区间分别为 48.28~265.45 mg•L^－1和49.41~136.93 mg•L^－1。统计结果显示两种蛋白质在肝癌组血清样品中浓度呈下调变化（p＝0.049;p＝0.002）,为进一步开展大样本的临床验证提供了基础。     

一种蛋白质质谱分析中快速胍基化新方法

胍基化修饰在蛋白质组学鉴定及定量研究中发挥着重要的作用,本研究建立了一种蛋白质质谱分析中微波辅助快速胍基化的新方法.采用标准肽段系统地优化了反应溶剂pH值、O-甲基异脲的浓度及微波加热时间,发现标准肽段在pH 12的氨水溶液中,O-甲基异脲的浓度为1.5 mol/L,微波高火加热1 min的胍基化效率为99％.将此方法...     

基质辅助激光解析电离质谱靶上样

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术已成为目前蛋白质组学研究中的经典技术。在该技术的成功应用过程中,合适的样品前处理方法起着首要和关键的作用。只有将合适的样品前处理方法与合适的有机基质结合起来,才能成功实现对多肽和蛋白质等生物大分子的准确鉴定。随着质谱分析向高灵敏度、高准确度、高通量的方向发展,出现了许多新的,可直接在MALDI靶上前处理的方法,极大地简化了对生物样本的处理步骤,同时减少了样品的损失。特别是将一些纳米材料用于MALDI靶上进行样品的前处理,为样品前处理方法的研究开辟了广阔的应用前景。     

胍基化修饰结合稀土金属标记应用于蛋白质相对定量研究

稀土金属元素标记技术利用双功能试剂二乙三胺五乙酸双酸酐(DTPA双酸酐)将稀土金属元素和目标肽段连接起来作为质量标签,结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析实现蛋白质的相对定量研究。为进一步提高标记效率,本研究对反应体系温度、pH值、反应时间和金属标签过量倍数等进行优化,并结合胍基化修饰技术封闭蛋白质酶切肽段中的侧链ε-氨基,使标记反应只发生在末端氨基,提高标记选择性。标准蛋白质实验结果表明,所有酶切肽段胍基化反应效率均大于95%,且胍基化修饰反应对金属标记效率没有影响。对于选定的7个标准蛋白质而言,每个蛋白质都至少有3个肽段可以得到良好的标记结果。对于离子抑制效应带来的干扰,可通过标准曲线进行校正,结果表明,当两种金属离子浓度比小于6时,该效应对蛋白质相对定量没有影响。胍基化修饰结合稀土金属标记方法不仅能在肽段水平实现相对定量,而且能在蛋白质水平实现相对定量。     

糖蛋白的质谱分析策略

糖蛋白是一类由糖类和蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白.它广泛存在于动物、植物、微生物及病毒中.近20年来的研究发现,糖蛋白中的糖基化修饰在各种生命现象中起着重要的作用.自19世纪末人们开始提出糖蛋白的概念并加以研究以来,先后明确了糖蛋白的糖基结构、多糖成分和部分生物学功能.同时,也能够识别糖蛋白中的糖苷键类型[1].     

热处理炉用循环冷却水阻垢剂的研制

热处理炉用循环冷却水的硬度大，容易在管壁上结垢，影响冷却效果，甚至影响设备的正常运行。根据本厂实际情况，采用碱性有机磷酸方案，研制了阻垢剂．介绍了阻垢剂单体的选择、配方试验和使用效果．