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利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体.采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率.结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20 mmol/L MgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2 h,涂板筛选得到较高的电转化效率.特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μg DNA.本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据. 相似文献
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对产单宁酶的1 株嗜热真菌HBHF5进行鉴定,开展单宁酶酶学性质的分析及碳水化合物活性酶(carbohydrate?active enzymes,CAZymes)的转录组学研究,探究嗜热真菌HBHF5在食品酶制剂开发中的潜力。经对菌株的菌落、孢子形态观察及ITS序列比对分析,最终鉴定嗜热真菌HBHF5为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。经分析,菌株HBHF5在固态发酵培养时不产单宁酶,而液态诱导培养时,菌株HBHF5胞内和胞外均检测到单宁酶活性,且以胞外酶为主(94%),酶活力最高达136?U/mL。单宁酶最适反应温度为60?℃,在60?℃处理30?min,能够维持酶原活力的90%以上。该酶最适反应pH值为6.0,在pH?5.0~9.0范围内,能够维持60%以上的酶活力。不同金属离子对酶活力的影响存在差异,Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+对该单宁酶活性抑制较强。经转录组学分析,该菌以麸皮为唯一碳源时,共有淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等239?个CAZymes基因表达,其中糖苷水解酶类最为丰富,约占CAZymes表达总数的70%。A. fumigatus HBHF5是1 株优良产酶菌株,为具有食品酶制剂开发潜力的嗜热真菌。 相似文献
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研究单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)对酶学性质的影响。通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)进行定点突变,构建单点突变体AfTanR316A和缺失突变体AfTanΔKR。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测发现两突变体Kex2蛋白酶抗性明显增强。经对酶学性质对比发现,两突变体具有较低的催化反应温度和较强的稳定性。单宁酶的最适反应温度由40℃(野生型)降低到20℃(两突变体)。突变体AfTanΔKR和突变体AfTanR316A在pH 12.0条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的0%提高到85%和60%;而在50℃条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的2%提高到40%和21%,上述性质的改变有利于单宁酶在低温条件的应用和酶制剂的生产贮存。突变体AfTanR316A动力学参数Km和Vmax分别为1.149 mmol/L和10.427 mmol/(L·min),AfTanΔKR的动力学参数Km和Vmax分别为1... 相似文献
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探究固、液发酵方式在重组毕赤酵母单宁酶工程菌的形态、产酶量及酶学特性等方面的差异。研究发现,重组菌株在固、液发酵方式下表现出了较大差异。固态发酵条件下,重组菌株能够积累更多的生物量,当培养48 h后积累的生物量比液态发酵高22.3%;经电镜分析发现,固态条件下,重组菌株个体之间更容易出现聚集,并伴随着有生物膜的产生;在不同甲醇体积分数诱导下,固、液发酵的重组菌株的产酶量均出现了先升高后降低的趋势,而诱导两者最高产酶量的甲醇体积分数却存在差异,分别是2%和3%。进一步研究发现,固、液发酵条件下,重组菌株发酵的单宁酶酶学性质也存在一定差异,固、液态发酵单宁酶的最适反应温度分别为30 ℃和为20 ℃,且酶的热稳定性也有一定提高,其余酶学性质差异不显著。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现,固态发酵生产的单宁酶存在不同的修饰,这可能是造成上述性质差异的原因之一。综上所述,本研究探究了固、液发酵条件下,重组单宁酶毕赤酵母菌株生长及产酶特性的差异,为高效制备单宁酶提供了一定的理论指导。 相似文献
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采用自行筛选的适用于作为高效冻干酸奶发酵剂的嗜热链球菌S.t-SY和保加利亚乳杆菌L.b-DR为出发菌株,在优化的麦芽复合汁增菌培养基上进行摇瓶增殖培养。通过研究培养温度、培养方式、基质起始pH值、接种量、中间补料方式等因素对乳酸菌摇瓶增殖培养的影响,优化乳酸菌摇瓶增殖培养的工艺条件。试验结果表明:在麦芽复合汁增菌培养基中乳酸菌增殖培养的最适条件是:培养温度37℃,基质起始pH值6.5~7.5,接种量0.2%~0.3%,静置培养16h,收获期S.t-SY和L.b-DR活菌数分别达到2.93×109、2.74×109cfu/mL。本试验结果为乳酸菌进一步应用麦芽复合汁增菌培养基生产高效浓缩直投式发酵剂提供了技术参数。 相似文献
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分析烟曲霉(Aspergillus fumigatus)HBHF5来源的GH5家族甘露聚糖酶AfMan5A和微孢根霉(Rhizopus microsporus)GZHF10来源的GH134家族甘露聚糖酶RmMan134C的酶学性质差异,探究两者协同降解多糖的潜力。结果表明两者酶学性质差异较大,AfMan5A的最适温度和pH值分别为60 ℃和6.0,而RmMan134C最适温度和pH值为35 ℃和5.0。金属离子Cu2+、Zn2+和Mn2+均表现出对2 个酶活性的抑制,而Mg2+、Fe3+和Li+可促进AfMan5A活性,却对RmMan134C活性表现出轻微抑制。甘露聚糖酶RmMan134C较AfMan5A底物谱广,两者最适底物均为魔芋葡甘露聚糖。进一步研究发现,两者并未对甘露聚糖类底物表现出协同效果,而是在微晶纤维素的降解中表现出较好的协同作用,协同系数为6.1。本研究分析了GH5和GH134家族甘露聚糖酶的性质差异及降解多糖的协同效果,为甘露聚糖酶的进一步应用推广提供一定的理论支持。 相似文献
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以实验室自行培育的平菇为实验材料,分别使用CTAB法、SDS-CTAB法以及高盐酶解法提取平菇基因组DNA,并通过紫外分光光度计、限制性酶切及PCR检测来衡量基因组质量。结果表明,使用CTAB法很难得到高质量的基因组DNA,OD260/280仅为1.5左右,而且伴有较多的杂质,电泳条带拖尾严重;使用EcoRI限制性酶对其进行酶切分析,效率较低,同时PCR检测不能得到有效扩增;而使用优化后的SDS-CTAB法及高盐酶解法提取平菇DNA,能够获得质量高、纯度好的基因组DNA,OD260/280基本保持在1.8~2.0之间,电泳条带较为清晰均一,使用EcoRI限制性酶对其进行酶切分析,酶切效果较好,并且DNA质量能够满足PCR检测的模板要求。说明SDS-CTAB法以及高盐酶解法提取的平菇DNA能够满足分子水平操作的要求,两者相比,前者成本较低,后者产率较高。 相似文献
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从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-Teasy载体中。然后用限制性内切酶EcoRⅠ和NotI对重组质粒pGEM-Teasy/ELA2B和毕赤酵母质粒pPIC9K进行双酶切,并且通过PCR技术去除ELA2B的信号肽,成功构建了真核表达载体pPIC9K/ELA2B,并将其转入毕赤酵母表达宿主GS115中。得到150株转化子,经含不同浓度G418的YPD平板筛选获得20株高拷贝转化子。甲醇诱导表达后,发酵液上清经SDS-PAGE检测,获得了大小约为28ku的目的条带。通过酪蛋白平板检测发酵液上清,出现透明圈,初步证明获得了有生物活性的弹性蛋白酶。 相似文献
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为挖掘新型GH134家族来源的甘露聚糖酶,评价其与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖的应用潜力,从小孢根霉GZHF10的基因组中成功获得1个新型GH134家族甘露聚糖酶(Rm Man134B),该基因编码181个氨基酸和1个终止密码子,经分析,与已报道的GH134家族活性基因的序列一致性较低(<69.6%)。采用大肠杆菌PET表达系统对该基因进行异源表达及性质测定,结果表明,该酶最适底物为魔芋甘露聚糖,最适温度和pH值分别为40℃和5.0。将魔芋粉在115℃和0.1 MPa的条件下进行非均相湿热处理,魔芋聚糖的结构和性质发生显著改变,其中处理2 h魔芋粉的溶液的表观黏度(30 g/L)降低96.1%,粉末粒径变小,热稳定性提高,改性魔芋粉的水解率提高0.6~1倍。进一步研究发现,Rm Man134B酶解产物的主要成分为单糖(0.922 mg/L)、二糖(1.4 mg/L)和三糖(0.613 mg/L)。本研究对魔芋甘露聚糖资源的高效利用和产业化发展具有一定的推动作用。 相似文献