甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达

将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游,形成重组克隆质粒pMD19TS3,进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT 2h,SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1,3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42 ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶30.4 U/mL。     

二硫键异构酶DsbC介导重组瑞替普酶在E.coli中可溶表达

瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建了reteplase、Dsb C表达载体p BAD/His A-R及p ACYCDuet-1-Dsb C,并共转化入E.coli BL21菌株,获得了瑞替普酶的Dsb C共表达体系。在此基础上,考察了发酵过程中诱导方式及时间、培养温度、诱导剂浓度对瑞替普酶可溶表达量的影响。在37℃、200 r·min-1的条件下培养到OD600值为0.6左右时,加入0.1 mmol·L-1的IPTG诱导二硫键异构酶Dsb C的表达;在25℃、160 r·min-1的条件下培养1 h后,加入0.5 g·L-1的L-阿拉伯糖诱导目标蛋白瑞替普酶表达,继续培养10 h收获菌体,结果表明近60%的瑞替普酶实现了可溶表达,其产量约为70 mg·L-1发酵液,用平板溶圈法测得纯化后瑞替普酶的活性为2.35×105 IU·mg-1。通过共表达二硫键异构酶Dsb C实现了瑞替普酶在E.coli中的可溶表达,有助于瑞替普酶的临床及折叠机理研究,对其他富含二硫键的重组蛋白质生产具有一定的指导意义。     

基因调控网络中的癌症标记物预测方法

基于多组学的癌症标记物识别对癌症分子机制的研究具有重要的意义,但是当前大部分工作都是结合蛋白质相互作用数据进行的,故提出一种新型的基于多基因调控网络和多组学数据的研究方法,用于分析癌症的分子机制以及预测生物分子标记物。该方法首先整合多组学数据,以胃癌和食管癌为例,分别构建了胃癌和食管癌的癌症特异性网络;然后在这两个网络上进行加权共表达网络分析,采用层次聚类划分模块,计算模块的第一主成分和所有已知癌症标记物的关系,以此为据筛选出癌症特异的模块;最后再提取疾病特异的生物通路,使用相似性评估方法识别潜在的癌症标记物。实验结果表明,该方法预测的特异性模块具有功能特性,并且在模块内部使用皮尔逊相关系数法进行预测的结果更准确。     

建筑文化遗产：一个时代的公共表达

自1949年中华人民共和国成立之日起,新中国的建筑事业就与文化遗产保护事业紧密相关、休戚与共。建筑是社会生活之必须,也是人类文明之载体,社会发展要求我们不断扩大建筑规模,而这种发展必须建立在已有文明成果的基础之上,才能具有民族传统、地方特色和时代精神     

人膜补体调节蛋白MCP、CD59在稳定转染的细胞中的共表达及功能研究

采取内核糖体进入位点(IRES)策略构建含人的膜补体调节蛋白基因MCP和CD59的cDNA的双顺反子真核表达载体pcDNA3-MCPIRESCD59,以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,用 G418筛选阳性克隆,并研究MCP和CD59双基因在稳定细胞系中的共表达及保护功能.PCR实验结果显示双基因稳定整合在异源细胞NIH3T3的染色体上,RT-PCR及Western印迹实验分别从 RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子MCP和CD59在细胞系中皆获得同步表达.检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-MCPIRESCD59,结果表明人MCP和CD59基因仍稳定整合在细胞基因组中,并未随着传代而丢失,为稳定的转双基因细胞系.补体依赖的细胞毒反应表明,pcDNA3-MCPIRESCD59转染细胞由于MCP和CD59的共表达获得了高于MCP或CD59单一表达时所提供的保护功效,能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生,保护宿主细胞免受人补体的攻击.以上结果表明,所构建的双基因重组表达载体实现了不同人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达,在克服超急性排斥反应的基因治疗中有潜在的应用价值.     

基因共表达网络的构建及分析方法研究综述

随着高通量生物实验技术的快速发展,特别是基因芯片和新一代测序技术的发展,全基因组范围内的基因表达数据呈爆炸式增长。利用网络生物学的方法对高通量基因表达数据进行分析和挖掘已经成为生物信息学重要的研究方向。对基因共表达网络的研究与分析从系统层面上加深了研究人员对生物系统的认识。本文综述了基因共表达网络的构建和分析的常用方法,主要包括基因相似性度量方法、阈值选择方法、拓扑分析方法、基因模块识别及其功能注释方法,并对一些常用的分析工具进行了分析总结。     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q10合成能力的影响

目的 强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力.方法 利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因.结果 首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍.检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍.结论 成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高.     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_(10)合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_（10）合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10（CoQ10）的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

相对行常量差异共表达双聚类挖掘算法

在生物信息学上,挖掘差异共表达双聚类有助于研究衰老、癌变类变化的生物过程。以往的差异共表达双聚类定义仅仅从一组基因的角度来衡量差异,导致包含了很多噪声。为了克服上述缺点提出新的差异共表达支持度MiSupport,可以将一组基因的差异细化到基因级别;并由此定义提出MiCluster算法,可以在两个真实的基因芯片数据中挖掘最大的差异共表达双聚类。MiCluster算法首先基于两个基因芯片数据构建差异共表达权值图,然后基于权值图,采用样本扩展和层次扩展,并利用精确的候选产生方法和高效的剪枝策略,挖掘出最大的差异共表达双聚类。实验结果证明,MiCluster算法比现有的算法快速高效,而且通过均方误差(MSE)测试和基因本体(GO)评价,挖掘出来结果具有更大的统计意义和生物学意义。