L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase,DPE）可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶（L-rhamnulose kinase,RhaB）具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,PPK）,可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta（DE3）中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35 ℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下：pH 8.5,温度35 ℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比（质量比）1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。     

通过解除磷酸糖胁迫提高枯草芽孢杆菌N-乙酰氨基葡萄糖合成能力

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)在食品、保健品以及药品领域有着广泛的应用。该课题组前期构建了一株具有较高GlcNAc合成效率的枯草芽孢杆菌底盘细胞FMIK,由于GlcNAc前体的过量积累引起了磷酸糖胁迫，限制了FMIK的GlcNAc产量。因此，该文首先通过实施荧光定量PCR验证磷酸糖胁迫对于glcR-ywpJ操纵子转录水平影响，并通过凝胶迁移率确定GlcR与P_glcR的结合能力；然后，利用易错PCR构建P_glcR-ep突变体库，设计并使用基于荧光检测的高通量筛选系统，鉴定得到P_glcR与GlcR结合的关键区域；最后，在FMIK菌株的基础上对筛选得到的P_glcR与GlcR的结合关键区域进行敲除，得到工程菌株FMIK-m4。该菌株有效降低了GlcNAc前体浓度，解除了磷酸糖胁迫导致的二次生长现象，且摇瓶内GlcNAc产量提高至18.21 g/L。     

D-甘露糖异构酶的酶学性质探究和热稳定性改造

D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化，在D-甘露糖的生物酶法制备中具有应用前景，但是目前报道的D-甘露糖异构酶热稳定性较差，无法满足工业生产高温的需求。该研究将大肠杆菌(Escherichia coli) Dh5α来源的D-甘露糖异构酶异源表达后进行酶学性质研究，并对其进行热稳定性改造。研究结果显示D-甘露糖异构酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6.0～7.0,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为963.4 mmol/L、1.38 s^-1、1.4×10^-3 L/(mmol·s)。通过理性改造该研究获得了一株热稳定性显著提高的突变体A241P/A116V/G253A/Q379P,其最适反应温度提高了15℃,在50℃条件下，半衰期为野生型的33倍，相对酶活力比野生型高60%。分子动力学模拟分析表明脯氨酸的引入和疏水作用的增强，提高了蛋白质的刚性，从而使热稳定性提高。该研究通过对主流来源的D-甘露糖异构酶进行酶学性质探究及热稳定性改...     

壳寡糖对过氧化氢诱导肝细胞损伤的改善作用及机制

目的：评估壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)对过氧化氢(H₂O₂)诱导肝细胞损伤的改善作用。方法：通过H₂O₂建立L-02细胞氧化应激损伤模型，对活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位以及IL-6、TNF-α等病程相关基因水平进行分析。结果：COS可改善H₂O₂损伤L-02细胞的增殖活力、抑制线粒体膜电位下降和ROS水平升高(P<0.05)。单细胞纳米生化分析结果显示，COS处理可以平衡H₂O₂损伤L-02细胞的ROS水平波动幅度。另外，COS改善了炎症(IL-6、TNF-α)、凋亡(Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2)及氧化应激(Nrf2、HO-1)相关基因转录水平，表现出抗凋亡和抗氧化应激的作用。结论：COS对H₂O₂损伤的L-02细胞具有保护作用，本实验可为COS的应用...     

生物反应器中表达ScFv大肠杆菌细胞自溶的分析

表达外源蛋白细菌培养过程中的细胞自溶现象是一个普遍性的过程工程问题。在相同发酵培养条件下,研究生物反应器中大肠杆菌W3110表达全人源化单链抗体片段(Single chain antibody fragments,ScFv)工程菌和野生菌的外源蛋白表达及细胞活性的差异,发现外源蛋白高效表达并积累在细胞内,大部分活细胞较野生菌提前6 h进入活着但不可培养(Viable but nonculturable,VBNC)状态,进而发生细胞自溶。分析工程菌与野生菌中胁迫应激和自溶途径基因转录水平表达谱,发现外源蛋白表达过程中热激途径rpo H,dna K,dna J,gro EL,gro ES;酸胁迫途径rpoS,gadE,gadX;氧胁迫途径sodA,katE均出现表达波峰,而发酵罐中细胞自溶过程中外膜蛋白基因ompA,ompC,ompW,ompX表达量显著下降,但rpoE并未出现持续高表达。这些发现为后续ScFv表达宿主细胞抗胁迫和自溶控制策略提供了新思路。     

燕窝中结合唾液酸调节5种益生菌生长以及孕妇肠道菌群组成的研究

膳食动物源黏蛋白存在结合态唾液酸聚糖，可能对人体营养健康产生影响。该文以一种富含唾液酸的黏蛋白—燕窝(edible bird’s nest, EBN)为研究对象，通过酸处理切除燕窝糖蛋白末端唾液酸(acidolysis bird’s nest, ABN),分别进行体外模拟消化，比较酸处理前后的燕窝及唾液酸单体在抗氧化活性方面的差异，以及对不同益生菌和孕妇粪菌在体外发酵的影响。结果表明，EBN比ABN和唾液酸具有更好的抗氧化活性。EBN以及唾液酸可不同程度改善乳杆菌和双歧杆菌菌株的生长，并增加短链脂肪酸的生成。同时，EBN可以显著促进阿克曼黏细菌的生长。在体外进行的健康女性和孕晚期孕妇粪菌发酵中，EBN在24 h内可显著增加乙酸、丙酸和丁酸的产量，其中丙酸的增加最为显著。同时，EBN还能够降低大肠杆菌-志贺氏菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等潜在致病菌的相对丰度，并增加潜在益生菌(如拟杆菌属、粪杆菌属和粪球菌属)的相对丰度。EBN在降低致病菌丰度和增加益生菌丰度具有比ABN更加显著的效果。因此，EBN中结合了唾液酸的完整性对其生物学功能起重要作用。     

可降解大豆过敏原蛋白酶的纯化与酶学性质

将前期筛选获得的芽孢杆菌Bacillus sp.BBE201108发酵培养后,以其发酵上清液作为蛋白酶的粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、透析除盐、Q FF阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析,蛋白酶的比酶活达到2 575.45 U/mg,纯化倍数为10.55,回收率为6.48%,经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,该蛋白酶的表观相对分子质量约为46 000。该酶与大豆分离蛋白在p H8.0,50℃下反应30 min,可有效降解β-伴大豆球蛋白的α亚基和α'亚基。在p H 7.0~9.0以及30~40℃下的稳定较好;Ca2+存在的情况下,酶活提高了5%左右,而Mn2+、Fe2+和Cu2+在不同程度上对该蛋白酶有抑制作用;苯甲基磺酰氟(PMSF)对该蛋白酶的抑制作用较为显著。酶学性质分析表明,该蛋白酶的Km为4.19 g/L,Vmax为4.04 g/(L·s),Kcat为107.73 s-1,Kcat/Km为25.71 L/(g·s)。     

七烯甲萘醌合成过程中关键蛋白的定位分析

七烯甲萘醌作为维生素K₂的重要亚型，在细胞中主要存在于细胞膜上，在氧化磷酸化的过程中起到电子载体的作用。作为七烯甲萘醌合成过程中的关键酶，1,4-二羟基-2-萘甲酸异戊二烯基转移酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid prenyltransferase, MenA)和甲基转移酶(methyltransferase, MenH)目前研究较少，其在细胞中的分布还未被研究，这也限制了七烯甲萘醌产量的进一步提高。该研究重点关注MenA和MenH在细胞内的分布问题，首先构建MenA、MenH和eGFP的融合蛋白，利用荧光定位的方法确定MenA和MenH在细胞中的定位。然后，使用表面活性剂Triton-100破坏细胞膜的结构，发现随着表面活性剂浓度的增加，七烯甲萘醌的合成受到明显抑制。该研究表明细胞膜结构的完整性是七烯甲萘醌合成的前提条件，并且揭示了七烯甲萘醌是在细胞膜上直接被合成，不是被转运到细胞膜中。研究结果为深入探索七烯甲萘醌合成机制提供了方向。     

枯草芽孢杆菌全细胞转化高效合成D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明:启动子PylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5mmol/L Mg²⁺。采用全细胞方法以500g/L D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖,4h内反应基本达到平衡,转化率为30.06%。研究旨在为D-阿洛酮糖工业规模化生产提供实验基础和理论依据。     

双歧杆菌胆盐水解酶基因的重组表达、纯化与酶学性质

为了提高胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达量,研究重组胆盐水解酶的酶学性质。利用大肠杆菌表达系统,对双歧杆菌来源的胆盐水解酶进行了表达。将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至表达载体p ET-22b(+),得到重组质粒p ET-22b(+)-bsh,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经发酵优化,重组菌在20℃、IPTG 1 mmol/L条件下诱导32 h可达最高酶活,对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2 U/m L和121.3 U/m L。采用镍亲和层析柱对重组胆盐水解酶进行纯化,经SDS-PAGE分析,胆盐水解酶相对分子质量(Mr)为35.0×103。酶学性质研究表明,重组胆盐水解酶偏好水解甘氨结合胆盐,对甘氨胆酸钠的催化活性最高,达到220.1 U/mg。酶催化反应的动力学参数经Hill方程拟合,希尔系数大于1,表明底物与酶之间存在协同作用,且不同底物与重组胆盐水解酶之间存在不同的协同作用,表明重组胆盐水解酶属于变构酶。研究结果为其他来源胆盐水解酶在基因工程菌中的表达,和进一步研究胆盐水解酶的结构和催化反应机理提供了参考。