抗肿瘤靶向工程菌的高密度发酵及菌粉研制

为获得侵袭性抗肿瘤靶向工程菌株EcNA高菌体浓度的培养基配方,在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验筛选出对菌体浓度影响最显著的因素为酵母抽提物、K2HPO4用量,对显著影响因素进行中心组合试验响应面分析。结果表明最佳培养基成分为：可溶性淀粉2?g/L、酵母抽提物50.3?g/L、K2HPO4?14.26?g/L、KH2PO4?3?g/L、MgSO4?0.3?g/L、微量元素母液2?mL/L、接种量3%。发酵后溶液中菌体OD600?nm?达到7.602,菌体生物量达到2.96×109?CFU/mL,比优化前提高了78.3%。以冻干保护剂在冷冻干燥过程中对工程菌株的保护效果为研究对象,通过正交试验得到制成菌粉的最佳保护剂配方为脱脂乳14.25?g/100?mL、蔗糖3?g/100?mL、抗坏血酸钠3?g/100?mL,优化后菌体冻干粉存活率可达86.32%,利于制成延长贮存期的口服菌粉胶囊。     

大肠杆菌工程菌产木聚糖酶工艺优化及酶学性质研究

对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在pH 2.5磷酸盐缓冲液中释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液中释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶的最适pH值为6.4,最适温度为55℃。该酶具有较好的热稳定性,含水分17%的酶在90℃条件下2.5min仅失活13.6%。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。     

特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化

应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。     

提高产反式-4-羟脯氨酸工程菌产量的发酵策略

为了实现羟脯氨酸的高产,首先以缺陷型菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH作为实验菌,通过单因素优化及正交试验,优化得到新的培养基配方及培养条件。其次通过基因工程手段引入透明颤菌血红蛋白VHB基因,构建菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV,进行高密度发酵。结果显示,发酵培养基为:麦芽糖10 g/L,甘油5 g/L,胰蛋白胨22 g/L,K_2HPO_44 g/L,FeSO_4(Fe~(2+)∶VC=1∶1) 5 mmol/L,MgSO_4·7H_2O 1.7 g/L,Nacl 3 g/L,Cacl_2 0.005 g/L;培养条件为:初始pH8.5,温度30℃,接种体积分数4%,转速220 r/min。此条件下,菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH羟脯氨酸产量约为1 602 mg/L,约为优化前的1.4倍.在7 L罐发酵培养,菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV的羟脯氨酸产量约为18.3 g/L,与JM109ΔargB/pUC19-BH相比,提高了13.2%,说明VHB基因的引入有利于羟脯氨酸产量提高.     

共表达抗氧化酶促进脂肪氧合酶在大肠杆菌中的表达

基于脂肪氧合酶(LOX)活性对宿主菌潜在的危害,分别共表达了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶,以期提高铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa BBE来源的LOX在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中的表达。将P. aeruginosa BBE超氧化物歧化酶基因sodB和sodM及E. coli过氧化氢酶基因katE克隆至pRSFDuet-1,分别得到表达质粒pRSF-sodB,p RSF-sodM和p RSF-katE,将上述表达质粒转化至表达LOX的重组大肠杆菌N6,得到菌株N6-B,N6-M和N6-K。在20℃和1 mmol/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导70 h,N6-B、N6-M和N6-K胞内外LOX总酶活分别为21.6、28.1和7.1 U/mL,其中N6-B和N6-M较对照菌株N6(11.8 U/mL)提高了83%和138%。通过正交实验确定LOX较优的诱导表达条件为:IPTG浓度2 mmol/mL,诱导菌体浓度(OD600)2.5,诱导温度20℃。研究结果表明:共表达超氧化物歧化酶能有效促进LOX在大肠杆菌中的表达,为该酶高效异源表达研究提供了新思路。     

一种便携快速微流芯片PCR仪性能评价

目的 评价一种便携快速微流芯片PCR仪的主要性能指标。方法 按照RB/T 160-2017《分析化学仪器设备验证与综合评价指南》、SN/T 2102.2-2008《食源性病原体PCR检测技术规范第2部分: PCR仪性能试验要求》等相关标准制定的评价指标及要求, 选取标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、肠炎沙门氏菌ATCC13076和大肠埃希氏菌O157:H7 ATCC43895食源性致病菌为检测目标物, 对便携快速微流芯片PCR仪的基线噪声、检测低限、线性、精密度、样品检测及重复性进行验证实验。结果 检测基线稳定、线性拟合相关系数r>0.98, 精密度均小于5%, 满足YY/T 1173-2010《聚合酶链反应分析仪》的要求。结论 基线噪声、检测低限、线性、精密度、样品检测及重复性6个指标可以有效的评价便携快速微流芯片PCR仪。     

牛源性非O157大肠杆菌的分离与鉴定

目的:对牛粪及牛肉中的非O157大肠杆菌进行分离、鉴定和毒力基因携带情况进行检测,以了解非O157大肠杆菌的污染状况。方法:参考USDA检测方法,对样品进行选择性增菌,用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行初步筛选,检测O抗原(O157、O121、O111、O103、O26),阳性样本用选择性显色培养基rainbow agar分离纯化,可疑菌株用多重PCR方法鉴定O抗原,PCR-限制性片段长度多态性鉴定H抗原,并采用血清凝集实验进行验证,确认的阳性菌株采用多重PCR方法进行毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)检测。结果:在153份牛粪和49份牛肉样本中,共40份样品检出1个或多个O血清型阳性,牛粪检出率高于牛肉,非O157阳性率为19.3%,O157的阳性率为0.50%;经分离纯化后,共鉴定出阳性菌株30株,其中O26最多占73.3%,O121、O103、O157分别占16.7%、6.7%、3.3%。毒力基因检测结果显示,分离自牛肉的2株O26:H11,一株stx1、hly阳性,另一株hly阳性,分离自牛粪的1株O26:H11携带hly基因,因此30株菌株中带毒菌株阳性率为10.0%,非O157产志贺毒素大肠杆菌阳性率为3.4%。结论:牛粪和牛肉中非O157大肠杆菌的污染率明显高于O157,尤其是O26:H11血清型最高,且检出含志贺毒素基因的大肠杆菌,这提示零售牛肉市场存在非O157大肠杆菌污染的安全风险,我国应该加强对非O157大肠杆菌的检测和监控。     

基于钴金属有机骨架材料（ZIF-67）催化性能的牛奶中大肠杆菌O157:H7快速定量检测

建立一种基于金属有机骨架催化性能的快速定量检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法。以2-甲基咪唑和CoCl2?6H2O为原料,Bola型两亲性表面活性剂为溶剂合成一种钴金属有机骨架材料（ZIF-67）。对ZIF-67的催化性能进行研究,发现ZIF-67具有和辣根过氧化物酶类似的催化活性,并能在无过氧化氢存在的情况下催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色。基于此建立一种通过磁性微球进行特异性富集,通过检测与靶标结合的ZIF-67的量间接检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法,该方法的检测范围为17～1.7×108?CFU/mL,检测限为17?CFU/mL,检测过程在1?h以内。该方法能快速、简单、高灵敏度、高选择性定量地检测出牛奶中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查中具有重要的应用价值。     

酸应激对大肠杆菌O157:H7生物菌膜形成的影响

本实验探究较长时间酸应激对大肠杆菌O157:H7生物菌膜形成的影响。首先采用微孔板联合结晶紫染色法比较大肠杆菌O157:H7不同菌株黏附性能差异,分析不同黏附力菌株菌膜形成曲线,进而选择代表菌株采用平板计数法分析在较长时间酸应激时其菌膜的形成规律,最后采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）比较黏附力不同的菌株在酸性环境下菌膜形态结构变化。结果表明,14 株菌株黏附能力有差异;不同黏附力菌株均在2 h开始产生黏附现象,但菌膜形成曲线有明显差异。以中等黏附力菌株ATCC43895作为代表菌株进行酸应激实验,结果表明pH值越低菌膜形成量越少,pH值相同时乳酸对浮游菌数和菌膜形成的抑制效应显著高于盐酸（P＜0.05）。CLSM观察结果表明,成膜能力较强的菌株J29和较弱的菌株CICC21530在中性和酸性培养液中均能形成一定结构的生物菌膜,但前者的菌膜形成量多于后者,酸性条件对成膜过程有抑制作用。提示乳酸能有效抑制大肠杆菌O157:H7菌膜形成过程,可为食品实际加工中该菌菌膜的消除技术提供科学思路。     

屠宰猪中大肠杆菌毒力基因检测及耐药性分析

为了解屠宰猪中大肠杆菌的毒力因子、种群分型以及耐药性情况,分析潜在的食品安全问题,为食品安全和临床用药提供理论依据,对来自屠宰猪中77?株大肠杆菌,包括陕西53?株、重庆16?株及河南8?株,进行毒力基因、种群分型及耐药性的检测。结果显示,iutA基因的检出率最高,优势群系为A群系;且菌株的耐药情况严重,12?种常见抗生素中对四环素、甲氧苄啶/磺胺甲二唑的耐药性普遍高。大多数菌株耐3～9?种药（90.91%）,最高可对11?种抗生素耐药。屠宰猪中存在耐药性菌株的污染,且极有可能是通过猪肉生产过程进入到食物链中,对消费者的健康存在一定的潜在危害,需要加强卫生监督。