两种不同来源富马酸酶酶学性质比较

目前L-苹果酸已经工业化生产,但仍存在苹果酸产生菌株来源有限和产量不高等问题,为了拓展苹果酸产生菌的种类及酶活性,通过基因工程手段分别利用pETDuet-1为载体在宿主细胞Escherichia coli BL21 (DE3)中重组表达了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(E.coli)来源的富马酸酶,并对两者的酶学性质以及催化效率进行了比较.结果表明:两种来源的富马酸酶均构建成功,谷氨酸棒状杆菌来源的富马酸酶(fumCc)最适温度和pH分别为30℃和8.0,大肠杆菌来源的富马酸酶(fumCe)最适温度和pH分别为40℃和7.0;酶动力学分析表明,fumCc酶催化效率(Kcat/Km)是fumCe的3.8倍.0.1g菌体细胞在10 mL转化体系中催化1.5 g富马酸钠,在各自的最适条件下反应6h,L-苹果酸的产率分别为85％和34％.     

纳米Ag/纳米TiO_2/CS复合膜材料的抗大肠杆菌特性研究

以壳聚糖CS为基质,添加纳米Ag和纳米TiO_2两种抗菌剂所制备的复合膜,针对大肠杆菌的抗菌性研究。实验根据前期单因素实验结果,设计了纳米Ag/纳米TiO_2/CS复合膜材料的三个因素的3个水平的正交实验,制备了不同优化工艺参数下的纳米Ag/纳米TiO_2/CS复合膜材料。同时,对制备的复合膜进行了抗菌性实验。探讨了优化工艺参数下的最优抗菌效果的工艺参数。结果表明:抗菌性最优工艺是:壳聚糖的浓度为4%,硫酸银的浓度为0.05mol/L,二氧化钛为0.007%时,纳米Ag/纳米TiO_2/CS复合膜材料的抑菌效果最好。研究结果为壳聚糖制备成生物质复合抗菌膜提供了理论及实验参考。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究

根据NCBI中的人胰岛素原基因序列及大肠杆菌密码子偏爱性设计特异引物,PCR扩增得到人胰岛素原基因,构建该基因的原核表达质粒p ET32-PI,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。对重组菌进行温度和IPTG浓度优化,发现重组菌在30℃和终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下表达效果最好且没有包涵体,经SDS-PAGE和Westem blot检测,表达蛋白的相对分子质量与理论相对分子质量一致且具有胰岛素的免疫原性,证明胰岛素原基因得到了正确表达。对重组菌进行流加发酵,发酵液离心收集菌体,破菌后上清液过亲和层析柱和离子交换柱分离纯化目的蛋白,透析后的样品用肠激酶和羧肽酶酶切,利用亲和柱去除融合蛋白与His标签,最终分离胰岛素样品,利用免疫酶标法,l m L样品测得活性92μIU,证明实验所得样品具有人胰岛素活性。     

姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究

为了探讨姜厚朴水提物(GMB)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理,试验对GMB作用下菌体形态结构、膜系统上离子通道的酶活力和能量代谢等方面进行了研究。结果表明,GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为6.25、12.5 mg/m L。大肠杆菌胞外AKP酶和β-半乳糖苷酶吸光度值分别增加1.78和4.24倍,GMB作用4 h后电导率显著上升,膜上Na+K+-ATP酶活性从0.42增加到1.74 mg prot/m L,且为阴性对照的1.7倍;金黄色葡萄球菌体表出现囊泡状、不规则的突起结构,SDH酶活性、总ATP酶活性和胞内蛋白质含量分别降低40%、23.4%和17.9%,且AKP酶活和电导率均有所增加。由此推测出GMB主要是通过破坏大肠杆菌细胞壁、膜结构,增加其渗透性和通透性,造成胞内物质外流和蛋白质合成量下降等现象,进而抑制菌体生长。而GMB抑制金黄色葡萄球菌的作用机制是增加细胞壁的通透性、降低能量代谢相关酶的活性,干扰其正常的代谢活动。     

新疆部分地区食源性大肠杆菌耐药性的研究

本研究对新疆乌鲁木齐、石河子、奎屯农贸市场以及超市的肉品、蔬菜、乳制品和即食食品中的大肠杆菌进行检测,从198份样品中分离出63株大肠杆菌。采用K-B法,对63株大肠杆菌进行17种抗生素敏感试验;采用PCR技术检测9种耐药基因。药敏结果表明,63株大肠杆菌对四环素(44.44%)、氨苄西林(39.68%)和萘啶酮酸(38.10%)耐药率较高,所有受试菌株对亚胺培南(0.00%)敏感性最强;肉品、蔬菜分离株对四环素(57.14%、52.94%)耐药性最强,乳源性分离株对氨苄西林(26.67%)耐药性最强,即食食品分离株对17种抗生素敏感;乌鲁木齐、奎屯、石河子分离株对四环素(65.00%、40.00%、32.14%)耐药率最高。PCR结果表明,耐药菌株中,sul2耐药基因检出率最高(75.00%),add B耐药基因的检出率最低(19.23%)。1重以上耐药菌株占总菌数的63.49%,3重以上耐药菌株占总菌数的39.68%。新疆地区食源性大肠杆菌多重耐药性比较严重。     

大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点,被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工,但是其制备成本高,价格较昂贵。该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶。首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因,将该基因通过质粒p ET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶。其次,对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析。结果表明,重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致,即59 k Da,重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg,最适作用温度降低了10℃,最适p H保持一致。所以,大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达,但是其酶学性质发生较大改变。     

以甘油为碳源发酵高产反式-4-羟脯氨酸菌株的选育及营养优化

以低品级甘油为碳源进行微生物发酵合成反式-4-羟脯氨酸(Trans-4-hydroxy proline,Hyp)的探索。从实验室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/p UC19-ptrp2-Hyp出发,通过易错PCR随机突变和常压室温等离子体复合诱变处理,利用单菌落琼脂块和氨基酸显色相结合高通量筛选出1株以甘油为唯一碳源的Hyp高产菌P71。与葡萄糖培养基相比,该菌株更适合在甘油上生长并转化L-脯氨酸合成Hyp,发酵20 h产Hyp高达1.20g/L,比生长在葡萄糖培养基上高70%以上;比其出发菌株在葡萄糖培养基上产量提高了1倍以上。通过培养基成分系统优化,发现胰蛋白胨、Fe SO4和L-脯氨酸是3大主要影响因素,最适加量分别为7.01 g/L、11.51 g/L和1.41 mmol/L;在该条件下突变菌株摇瓶发酵12 h产Hyp达1.61 g/L,比优化前提高了50%。     

1株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及发酵初步优化

顺式-4-羟基-L-脯氨酸是一种可用于合成多种药物和香料的手性结构物质。通过对L-脯氨酸顺式-4-羟化酶基因的优化设计,并引入色氨酸串联启动子,构建出1株能表达L-脯氨酸顺式-4-羟化酶的重组大肠杆菌JM109/p EHC4,从而可以将游离的L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸。对该菌株进行摇瓶发酵优化,得出优选培养基为(g/L):葡萄糖10,甘油10,蛋白胨10,NaCl 6,FeSO_4·7H_2O 0.278,L-抗坏血酸0.528,(NH_4)_2SO_45,K_2HPO41,MgSO_40.2,CaCl_20.015,L-脯氨酸4。在该条件下发酵12 h,顺式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到657.08mg/L,比优化前提高了3.76倍;在24 h时产量达到1 582.75 mg/L。研究结果为顺式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物转化法生产提供了基础。     

紫外线对饮用水中两种代表性微生物的灭活研究

使用CS型紫外线消毒装置,以自来水中易被灭活的大肠杆菌和不易被灭活的枯草芽孢杆菌为代表性微生物进行灭活实验,对其灭活效果分析。实验结果表明:在紫外线照射剂量较小时,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的存活数和灭活率都随生物负荷的增加而增加。相同条件下,紫外线对大肠杆菌的灭活效果明显,当紫外线剂量为9.9m J/cm~2时,灭活效果达到3.2个对数级。由于浊度对水的透光率有一定的影响,所以影响紫外线对大肠杆菌的灭火效果,当浊度达到4NTU时,灭活效果明显降低。紫外线对枯草芽孢杆菌的灭活效果比氯好,当CT值为300mg/(L·min)时,芽孢杆菌灭活率达到0.53个对数级。当紫外线剂量为41.3m J/cm~2时,枯草芽孢杆菌灭活效果达到3.2个对数级。与经过48h培养的枯草芽孢杆菌相比,24h培养的芽孢杆菌对紫外线更敏感,灭活率更高。