乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶的分离纯化

本研究确定了分离纯化乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶(CEP)的最佳技术路线.用裂解液(50mmol/L Tris-HCI,2mmol/L EDTA-Na2,100mmol/L NaCl,0.5%Tritonx-100,1mg/ml溶菌酶,pH8.5)悬浮菌体(20ml/g),37℃下保温3h,离心后取上清液即为粗酶液.粗酶液通过45%硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadcx A-25和Sephacryl-S-300 HR两步层析,可以得到纯化的细胞壁蛋白酶.蛋白酶提纯倍数达到74.048%,最后回收率为14.865%,PAGE电泳检测为一条带,SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构,分子量大约为53kD.用纯化后CEP酶解乳清蛋白,酶解液ACE抑制率为45%.     

基于PtNPs-PV的双重放大免疫比色法检测肉中莱克多巴胺痕量残留的研究

本文提出了一种免疫比色方法用于检测猪肉中莱克多巴胺的残留。该方法结合了抗原抗体特异性结合的高选择性特点和胶体铂颗粒(Pt NPs)与多聚酶螯合物复合物(Pt NPs-PV)的信号放大效应,能特异、灵敏地检测样品中痕量的莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)残留。多聚酶螯合物(Power Vision,PV)上含有二抗和大量的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),与抗体特异结合的同时催化底物二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)产生显色沉淀,并且胶体铂颗粒(Pt NPs)也能催化DAB产生显色沉淀与复合物,从而达到双重放大效果。通过测定DAB沉淀吸光度的变化能对应计算样品中莱克多巴胺的残留量。结果表明,在优化的测定条件下,该方法具有较高的检测灵敏度并在0.05~20 ng/m L范围内具有良好的相关性,R2=0.992,检测下限是0.025 ng/m L。所提出的方案具备灵敏度高、选择性强、准确性高且检测速度快等优点,可以适应猪肉中莱克多巴胺残留的现场检测需求。     

海藻酸钠抗菌复合涂膜对冰鲜鸭肉保鲜效果的影响

试验选择ε-聚赖氨酸(ε-PL)为生物源抗菌剂,添加柚子皮微晶纤维为增强剂,研究复合海藻酸钠涂膜试验对冰鲜鸭的保鲜效果的影响。采用SEM对复合膜的微观结构进行分析,研究了复合涂膜对冰鲜鸭肉储藏过程中的p H、挥发性盐基氮(TVB-N)、水分流失率、微生物指标、色差变化的影响。试验结果表明:ε-PL的添加有效增强了复合膜的抑菌性能,柚子皮微晶纤维的添加使复合膜内部形成稳定有序的网状结构,改善ε-PL分散性和稳定性;与空白对照组及单一海藻酸钠涂膜相比,1%ε-聚赖氨酸/海藻酸钠有效控制了冰鲜鸭肉储藏过程中TVB-N含量的升高,显著降低鸭肉的菌落总数和大肠杆菌菌落数(p0.05),1%ε-聚赖氨酸/0.1%柚子皮微晶纤维/海藻酸钠可以显著改善冰鲜鸭肉的水分流失(p0.05),保持鸭肉的鲜红色泽。该研究为海藻酸钠抗菌复合涂膜应用于冰鲜鸭肉保鲜包装提供了新的参考。     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

研究分离纯化发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶(cell envelope proteinase,CEP)的方法及其酶学性质。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)悬浮菌体,进行超声波破碎,细胞质量浓度为0.06g/mL,破碎功率330W,工作220次(工作时间3s,间隔时间5s),离心取上清液即为粗酶液。60%硫酸铵沉淀,Sephacryl S-300 HR凝胶层析,Native-PAGE割胶回收纯化发酵乳杆菌的CEP。用纯化的CEP 酶解脱脂乳,酶解液ACE(angiotensin I-converting enzyme)抑制率为50%。SDS-PAGE检测CEP分子质量为32.5kD,最适酶反应温度为41℃,最适酶反应pH值为8.0。Mg2+、Co2+、Ca2+对CEP活性有激活作用;Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对CEP活性有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶且酶的活性中心结构的维持与金属离子有关。     

壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶的条件研究

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,采用交联-吸附法对瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化条件进行研究。在单因素试验基础上,以固定化酶活力为主要指标,研究凝结液、壳聚糖质量浓度、酶用量、交联时间、戊二醛质量浓度对瑞士乳杆菌蛋白酶固定化的影响。运用响应面对固定化条件进行优化,确定瑞士乳杆菌蛋白酶的最优固定条件：凝结液为4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL,此时固定化酶活力为28.67U。     

植物乳杆菌LPb1耐受性及发酵乳制备条件的优化

模拟人体消化道环境,即在人工胃液、肠液的环境下对植物乳杆菌LPb1的耐受性进行研究,结果表明：在37℃条件下,用人工胃液处理3h,收集的菌体再转入人工肠液处理3h,最后测得菌株存活率仍达88.6%。LPb1与一株嗜热链球菌混合发酵脱脂乳,与单菌发酵相比,混合菌产酸效果较好,发酵乳制品具有良好的持水性能,且发酵完成后,4℃冰箱贮存后酸化程度缓慢。通过单因素和响应面分析,混合发酵最佳发酵条件为：接种量4.45%、发酵时间8.53h、发酵温度40.40℃。     

重组融合蛋白MBP-BSH 在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3) (pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。     

基于DNA核酸适配体序列的超灵敏比色法检测牛乳中的雌二醇

分别利用最适长度的雌二醇DNA核酸适配体的特异性识别和胶体金聚集前后颜色及吸光度的变化实现雌二醇的定性和定量检测。本研究制备了胶体金,并设计了75-mer、35-mer和22-mer的雌二醇核酸适配体,依据没有核酸适配体保护的胶体金在最适氯化钠浓度条件下聚集,而有核酸适配体保护的胶体金在此浓度条件下不聚集以及雌二醇的核酸适配体与雌二醇特异性结合的特性,实现对雌二醇的超灵敏检测。结果表明,在Na Cl浓度30 mmol/L、35-mer核酸适配体质量浓度30 nmol/L条件下,雌二醇质量浓度与胶体金在625 nm和523 nm波长条件下,吸光度的比值(A_(625) nm/A_(523) nm)在13.6~54.4 pg/m L的范围内呈良好的线性关系,检测限为2.7 pg/m L。所构建的比色法的特异性、稳定性和重复性均良好。应用该方法对牛乳样品进行检测,雌二醇的最低检测限为13.6 pg/m L,因此可用于奶制品中雌二醇的快速检测。     

不同蛋白酶制备鹅肉呈味肽的对比分析

以鹅肉为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶制备呈味肽,对比分析4 种酶解液中的水解度、寡肽含量,采用氨基酸自动分析仪对酶解液游离氨基酸组成进行测定,并利用电子舌和感官评定方法对酶解液的鲜味等味道进行滋味评定。结果表明：45 ℃恒温水浴酶解6.5 h,加酶量1 200 U/g、pH 7.0、固液比1∶3（g/mL）的条件下,木瓜蛋白酶酶解液水解度最大且寡肽质量分数最高,其次是中性蛋白酶,鹅肉蛋白水解度达到29.69%,寡肽质量分数达到0.18%。此外,中性蛋白酶酶解液的风味最好。中性蛋白酶酶解后产生的游离氨基酸类型丰富,谷氨酸和丙氨酸的含量高,最终酶解液整体鲜味浓郁,并伴有酸味。因此,确定酶解鹅肉蛋白的最佳用酶为中性蛋白酶。     

嗜酸乳杆菌ATCC4356分选酶A基因克隆、表达及功能分析

分选酶在细菌对宿主细胞的黏附过程中具有重要作用。为探究乳酸菌分选酶的特性及与其他致病菌分选酶的差异,以嗜酸乳杆菌ATCC4356为模板,构建分选酶A（sortase A,SrtA）重组表达载体pET28a-SrtAΔN48,转入大肠杆菌感受态细胞Transetta（DE3）内表达,使用Dabcyl-QALPTTGEE（Edans）探究其酶活特性。结果发现：嗜酸乳杆菌ATCC4356 SrtA（Lap-SrtAΔN48）分子质量为20kDa左右;Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋可提高Lap-SrtAΔN48的转肽能力;Ca2＋不会影响SrtAΔN48的活性,明显区别于致病菌;且分选酶抑制剂查尔酮会抑制Lap-SrtAΔN48的活性。进一步通过蛋白质同源建模分析发现Lap-SrtA由8条中心β桶状结构互相折叠而成,属于经典的分选酶结构,Lap-SrtA的活性位点为His137、Cys198、Arg205。