基于PCR技术的肉类成分溯源鉴定方法研究进展

近几年屡屡曝光的食品安全事故引起了社会的广泛关注,食品安全已经成为社会共同关注的问题,肉类掺假造假现象更是层出不穷,其中用低价鸡肉、鸭肉、猪肉等掺入、冒充牛羊肉成为主要的掺假方式。国内外进行肉类掺假鉴定主要以核酸作为靶标,核酸鉴定也是物种鉴别最常用、最核心的方法,以DNA检测为基础建立起来的DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR、荧光探针等技术也得到空前发展和广泛应用。我国针对动物源性成分检测也制定了相关国家标准和行业标准,但大多现行标准中基于DNA检测建立的PCR技术只能检测单一物种,滞后于技术的发展。目前,基于PCR发展起来的衍生技术凭借其高灵敏度、强特异性和高通量等优势在动物源性成分检测工作中显示出巨大潜力,也是肉类成分鉴定未来的重要方向。本文综述了PCR技术在肉类检测中的研究概况和现行标准的技术概况,以期为肉类成分鉴定研究提供信息。     

拉曼光谱技术在农产品药物残留检测中的应用

近年来,农产品药物残留超标引发了一系列食品安全问题,为了保障国家食品安全、保护消费者健康,需要对农产品中的药物残留进行定性定量检测。表面增强拉曼散射技术 (Surface-enhanced Raman scattering , SERS) 是一种极具吸引力的工具,可用于高效检测农药残留。本文介绍了表面增强拉曼光谱检测技术的概况,简介了拉曼增强基底,分析了表面增强拉曼光谱技术在药物标准溶液、农产品(肉类、水产品、果蔬和其他部分农产品等)药物残留检测领域中的研究现状,并针对当前农产品药物残留检测的发展趋势进行前景展望。     

高效液相色谱-串联质谱法测定芒果中六种链格孢霉毒素残留

本文建立了高效液相色谱-串联质谱法快速检测芒果中链孢酚单甲醚、交链孢霉烯、细交链孢菌酮酸、格链孢酚、腾毒素和细格菌素6种链格孢霉毒素的方法。样品经改进的QuEChERS方法进一步完成萃取净化,以带皮全果和无皮果肉芒果样品为基质,在样品中加入适量的水,以1.5%甲酸-乙腈溶液为提取剂,无水MgSO₄为除水剂,NaCl盐析,振荡混匀,在9500 r/min下离心5 min,取上清液加水稀释过膜,以Waters ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)分离,电喷雾正离子多反应模式监测。在本方法条件下,6种链格孢霉毒素在0.5~200 ng/mL的浓度范围内线性关系良好,R2>0.9925,在S/N=3时,检出限在0.6~3.0 μg/kg之间。在5、10、20 μg/kg三个加标水平下,6种链格孢霉毒素的回收率在82.5%~110.6%,相对标准偏差小于10%。该方法简单高效,可以用于芒果中6种链格孢霉毒素的测定。     

基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用

目的：建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法，为其基层检测的展开提供依据和便利。方法：利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD)，辅以手持式胶体金读数仪；根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物，通过对反应条件和体系的优化，以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验，成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果：在引物浓度400 nmol/L，引物比例1:1时，该方法最佳反应条件为Mg²⁺浓度14.0 mmol/L，反应温度37℃，反应时间20 min；灵敏度好，标准曲线方程为y=0.117x+0.051，定量限为10¹～10⁸ copies/μL，检出限为10¹ copies/μL，比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利...     

水杨酸信号路径在调控入侵生物烟粉虱诱导植物间接防御中的作用

当植物受到植食者为害后,能够迅速合成并释放出一些挥发性物质,进而吸引植食者天敌,达到控制虫害的目的.大量的研究表明,茉莉酸信号路径在调节植物释放挥发物的过程中发挥了重要作用.然而,最近的研究表明,外来入侵刺吸式昆虫如烟粉虱,能通过激活植物体内的水杨酸信号路径,同时还能抑制茉莉酸信号路径.那么,水杨酸信号路径是否在刺吸式昆虫诱导植物释放挥发物吸引天敌过程中发挥重要作用?我们分别以拟南芥和番茄作为模式植物,研究经烟粉虱取食为害后的野生型植株以及不同信号路径突变体植株对丽蚜小蜂的嗅觉行为反应.研究结果表明,烟粉虱为害120h后的野生型拟南芥或番茄植株均能够显著吸引丽蚜小蜂.当茉莉酸路径被抑制时,烟粉虱为害后的拟南芥(dde2-2)或番茄(def-1和spr-2)植株同样显著吸引丽蚜小蜂;但是当水杨酸路径被抑制后,烟粉虱为害后的拟南芥(NahG和npr-1)或番茄(NahG)植株则并未吸引丽蚜小蜂.植物激素分析结果表明,烟粉虱能够诱导拟南芥或番茄植株内源水杨酸含量显著增加,但内源茉莉酸的含量则并未变化.因此,我们认为水杨酸信号路径在调控烟粉虱诱导植物间接防御过程中发挥重要作用.     

黑木耳多糖模拟水解物的抗氧化及胃肠道分布规律研究

探讨体外人工胃液肠水解黑木耳多糖片段的抗氧化活性及其在小鼠消化道内的动态分布规律。依次采用碱提醇沉,脱蛋白,人工胃肠液水解,透析,凝胶柱层析(Sephadex G100)得到5种黑木耳多糖组分(AAPF-1,AAPF-2,AAPF-3,AAPF-4,AAPF-5),利用体外OH·和DPPH·清除率和线虫H2O2抗性实验分析5种多糖的活性。利用异硫氰酸荧光素标记黑木耳多糖获得AAPF-1-Tyr-FITC,追踪其在小鼠胃肠道内24 h的动态分布规律。结果表明,5种黑木耳多糖组分中,AAPF-1(0.4 mg/m L)对OH·与DPPH·清除率均为最高,分别达68.54%与42.18%,并在60~150 min内均可显著延长线虫寿命。AAPF-1经胃很快排空到小肠,在小鼠小肠基本不吸收,而在大肠中的存留时间在24 h以上。     

茶叶中镉、铅、砷的浸出规律及快速测算方法研究

为明确茶叶中镉、铅、砷的浸出规律,探索茶叶中相应重金属元素的快速测算方法,分别采用微波消解和沸水浸提方法进行前处理,运用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定了茶叶、茶水和茶渣中的镉、铅、砷的含量,研究了3种元素的浸出规律及快速测算方法。结果表明,所测茶叶中镉、铅、砷的含量均未超过国家限定标准。在本研究提取条件下,镉、铅、砷三种元素在浸提20min茶水中的含量与其在茶叶中的含量均呈线性关系,镉的线性方程为Y=7.40623X+0.0235(r=0.9999),铅的线性方程为Y=5.44998X+0.03008(r=0.9935),砷的线性方程为Y=2.25405X+0.01115(r=0.9822)。因此,可以通过测定茶水中的镉、铅、砷含量来评估茶叶中的镉、铅、砷总量,以实现对茶叶中镉、铅、砷含量的快速测算;本研究明确了镉、铅、砷的浸出规律,提供了一种快速提取和检测茶叶镉、铅、砷含量的新方法。     

4组鱼类DNA条形码引物的筛选与优化

目的通过对DNA条形码氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I,COI)的4组常用引物进行比较筛选,选择适于舟山鱼类鉴定的最佳引物。方法以舟山主产大黄鱼、小黄鱼、带鱼和乌贼样品DNA为模板,对4组常用DNA条形码引物进行PCR体系优化。通过比较PCR产物量、特异性、灵敏度和测序成功率,综合分析筛选最佳引物组。结果 4组引物均能扩增大黄鱼、小黄鱼和带鱼的DNA,对于乌贼DNA的扩增具有明显差异。COI优化引物具有易于扩增、测序简单等优势,更适于作为海产品鉴定的DNA条形码引物。结论本研究为舟山海产品的市场监管和实验室大量样品检测提供了技术参考。     

PCR-DGGE技术分析传统臭鳜鱼发酵过程中细菌群落结构

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术对黄山臭鳜鱼发酵过程中的细菌群落结构组成进行研究。以发酵0~8 d的臭鳜鱼为研究对象,每2 d取样,提取样品的总DNA,同时进行16S r DNA V6~V8区的PCR扩增,产物纯化后进行DGGE分析。结果表明:肠球菌(Enterococcus sp.,D带)、腐败西瓦氏菌(Shewanella putrefaciens,C带)、溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus,A带)和乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum,F带)在整个发酵过程,特别是发酵后期占较大比例,是黄山臭鳜鱼发酵过程中的优势菌。臭鳜鱼样品的PCR-DGGE图谱相似度分析显示,臭鳜鱼发酵后期菌群结构比较相似,微生物菌落结构趋于稳定。本研究结果为筛选适合工业化生产的发酵菌株,有效控制臭鳜鱼生产中存在的腐败菌、致病菌,对提高臭鳜鱼安全性和产品品质具有一定应用价值。     

家禽屠宰场微生物菌群结构及大肠杆菌耐药性评估

家禽屠宰场的水体、地面和屠宰器械表面微生物对鸡肉微生物交叉污染有重要的影响。本研究的主要目的是分析家禽屠宰场水体、地面和与鸡肉接触的屠宰器械表面的细菌结构及其耐药基因携带状况,并从中分离大肠杆菌进行耐药性评估和肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction,ERIC-PCR）分型分析。在浙江省某大型屠宰场的挂禽间、宰杀沥血间、浸烫脱羽间、净膛间、预冷间、包装间、冷藏间、内脏间区域采集水体,并用无菌纱布擦拭各区域的地面和器械表面采集微生物,基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量测序方法分析其菌群结构多样性,并从中分离大肠杆菌,分别用PCR对总细菌和大肠杆菌进行9大类耐药基因的检测分析和大肠杆菌的ERIC-PCR分型研究。结果表明：屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主;优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）等一些腐败菌属与致病菌属。屠宰场不同区域的水体、地面和屠宰器械表面存在的耐药基因种类较多,共检测到21 种耐药基因分布在这些样品中,其中sulI、sulII、blaTEM、aadA1、floR、tetA、ereA和qnrS等8 种耐药基因检出率达88.9%以上,与从中分离的大肠杆菌耐药基因检出情况吻合度较低,这表明还存在其他携带耐药基因的菌株,此外分离的大肠杆菌菌株多重耐药现象严重。ERIC-PCR分型结果表明,大肠杆菌可以沿屠宰生产链进行克隆传播。本实验将为探究屠宰环境微生物与鸡肉污染微生物之间的关系提供理论参考。