多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达

生物胺是存在于发酵食品中的一类有机物，过量摄入会危害人体健康。多铜氧化酶中的某些酶具有降解多种生物胺的活性，在减控发酵食品中的氨(胺)类危害物方面具有良好的应用前景。研究多铜氧化酶的分泌表达，对酶的特性改造和工业化生产与应用具有重要意义。本研究通过在解淀粉芽孢杆菌来源的多铜氧化酶N端融合信号肽PhoA实现了多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达，胞外酶活为69.8 U/L。通过优化诱导条件和酶的分泌确定了多铜氧化酶最优发酵条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.05 mmol/L、诱导时菌体OD600=1.0、诱导6 h后添加150 mmol/L甘氨酸；发酵40 h时胞外多铜氧化酶酶活达到238.1 U/L，是优化前的3.4倍。     

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中，通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽，该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选，发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD，并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇，具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮（ADD）为底物通过化学法合成，但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应，实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析，筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮，结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高，因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L^-1、底物浓度为5.40 g·L^-1条件下，经过两次补料，获得了3.66 g·L^-1宝丹酮，比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。     

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。     

定点突变提高食品新型L-天冬酰胺酶的活力及热稳定性

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase II，EC 3.5.1.1）可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸，减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成，因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注，但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性，对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变，并在Bacilus subtilis 168 中进行表达，提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%，突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%，突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴，提高了其在食品工业中的应用前景。     

甘油预处理蔗渣的木质素分离提取及结构表征

以甘油分别对甘蔗渣进行常压甘油自催化（AGO）预处理和常压甘油碱催化（al-AGO）预处理。利用酸沉法分别从预处理液中得到自催化甘油木质素（AGOL）和碱催化甘油木质素（al-AGOL）。利用单因素实验和正交实验得到最佳木质素提取工艺为转速8000r/min、离心时间15min、甘油混合液pH为3、甘油混合液浓度10%，在该条件下木质素AGOL和al-AGOL提取率分别达到72%和76%。采用扫描电镜（SEM）、元素分析、紫外光谱（UV）、凝胶色谱（GPC）、核磁共振¹H谱、热重分析以及抗氧化活性分析等技术手段对提取得到的木质素进行结构表征。结果表明：从甘蔗渣中提取的球磨甘蔗木质素（MBL）、AGOL和al-AGOL主要呈现出球形特征；AGOL和al-AGOL具有相似的活性特点，与MBL相比，AGOL和al-AGOL的分子量更小、分布更窄、均一性更好，热稳定性和抗氧化活性更高，有望成为重要的工业原料。     

Pycnoporus sp. SYBC-L3漆酶催化偶氮染料脱色

为考察 Pycnoporus sp. SYBC-L3漆酶Lac-L对偶氮染料的脱色、解毒效果，探究最佳的脱色反应条件，采用单因素分析方法研究了不同的反应条件对Lac-L催化3种偶氮染料（AR1、RB5、RV5R）脱色的影响，得到最佳处理条件，并通过比较被漆酶降解前后的染料对小麦和水稻发芽率及根、芽生长的影响，分析其毒性变化。结果表明：在以HBT为介体、反应温度50 ℃、pH分别为4.0（AR1，RV5R）和5.0（RB5）、漆酶用量1 U/mL、染料初始质量浓度分别为30 mg/L（AR1）和50 mg/L（RB5、RV5R）条件下，漆酶对3种偶氮染料的脱色效率最高，AR1和RV5R几乎完全降解，脱色率达到96.1%和97.8%，而RB5也有83.8%的脱色率。植物毒理实验表明，3种偶氮染料经漆酶降解后对小麦和水稻发芽率没有影响，对胚芽和根生长的抑制作用也有所降低。     

谷氨酸结晶中的细晶回用工艺

谷氨酸工业结晶过程中会产生大量难以分离回收的细晶,影响收率和产品质量。文中提出了结晶-粒径切割沉降-细晶回用的工艺设想,将不同粒径的晶体分步分离,细晶浓缩后作为晶种回用至结晶过程。使用扫描电镜和粉末X-衍射(PXRD)研究细晶的晶习及其作为晶种回用的可行性,进行不同条件下的分批等电结晶,参考结晶速率、聚结度、CSD等参数确定细晶回用量、适用过饱和度范围等回用条件。结果表明:液体细晶表观为非典型四方六面体,但在谷氨酸结晶中晶面具有自我修复能力;过饱和度和细晶回用量均影响结晶过程,液体细晶的最适过饱和度范围为1-3;在过饱和度S=2时液体细晶的最适回用量(质量分数)为1%,在S=3时最适回用量为3%。最终证明通过控制合适的晶体生长环境,细晶回用的谷氨酸结晶工艺是可行的。     

重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol,BT）属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjhG和yqhD构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjhG和yqhD的表达。结果发现,以P _inv 表达醇脱氢酶基因yqhD使BT产量达到14.4g/L;以P _tac 表达脱氢酶基因xdh和P _{rrnH P1}表达脱水酶基因yjhG的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。