重组复杂蛋白快速表达体系的建立

目的建立重组复杂蛋白快速表达体系。方法利用定点整合技术建立定点整合宿主细胞库,分别以X-Fc融合蛋白和人凝血因子Ⅷ(FⅧ)为研究对象进行定点整合转染和表达分析。结果通过定点整合转染建立了高表达的宿主细胞库;X-Fc融合蛋白和人FⅧ均在宿主细胞中获得了高表达,X-Fc融合蛋白的表达量为220 mg/L,人FⅧ在有血清培养条件下的酶活性为2 IU/ml,且细胞株表达稳定,易于扩大培养。结论已成功建立了基于CHO细胞定点整合的重组复杂蛋白快速表达体系,该体系在克隆效率和时间上具有很大优势,可实现蛋白的有效快速表达。     

高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。     

细菌诊断血清吸收菌杀菌剂的改进

长期以来，我国制造细菌诊断血清的吸收菌采用较高浓度的甲醛溶液杀菌。由于甲醛能使蛋白质变性，降低血清效价及稳定性，故吸收菌在使用前须经3次离心洗脱甲醛，不仅耗费人力物力，生产周期长，而且吸收菌易自凝。我们根据文献资料和自己的经验，设计试验了适用于沙门氏菌、志贺氏菌、病原性大肠艾希氏菌诊断血清吸收菌的杀菌剂，即0．1％碘化汞与0．1％福尔马林的混合液，并与传统的福尔马林杀菌法作了比较。本试验共用21株菌种，包括沙门氏菌10株，志贺氏菌7株及病原性大肠艾希氏菌4株。试验了3种碘化汞杀菌剂浓度，即0．1％碘化汞与0．3…     

抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因在CHO细胞中的表达

目的构建抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因,并在CHO细胞中表达。方法采用RT-PCR及RACE技术从鼠杂交瘤细胞克隆免疫球蛋白可变区基因,与人免疫球蛋白恒区基因拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因,转染CHO细胞并测定其表达量。结果构建的嵌合抗体基因在CHO细胞中的初始表达量为0.71μg/ml,亚克隆后表达量达0.95μg/ml。结论已成功构建抗人TNF-α嵌合抗体基因,并在CHO细胞中得到了高效表达。     

重组人凝血因子Ⅸ在CHO细胞中的表达和纯化

目的在CHO细胞中表达并纯化人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)。方法将高表达hFⅨ的CHO细胞株在摇瓶中用无血清培养基进行批次培养和补料批次培养,收获补料批次培养上清,通过阴离子交换层析进行纯化,测定纯化产物的蛋白浓度及hFⅨ活性,并进行SDS-PAGE分析。结果批次和补料批次培养表达的hFⅨ活性分别高达0. 62和14. 45 IU/mL。纯化后的h FⅨ比活性高达157. 19 IU/mg。SDS-PAGE分析表明重组CHO工程细胞株能正确表达hFⅨ。结论成功在CHO细胞中表达并纯化了高比活性的重组hFⅨ蛋白,为进一步研制重组FⅨ药物奠定了基础。