食源性诺如病毒单克隆抗体可变区基因克隆及结构特征分析

食源性诺如病毒是引发全球食品安全事件的重要病原,近年来新冠疫情的持续肆虐,更突显了加强食品领域病毒安全研究的紧迫性。该研究以实验室前期获得的食源性诺如病毒高效单克隆抗体为对象,克隆并系统分析了其重链和轻链可变区基因序列。从分泌食源性诺如病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3中提取总RNA,通过RT-PCR扩增单克隆抗体1E3的重链可变区VH和轻链可变区VL的DNA序列。将产物克隆到PMD19-T载体,测序并分析其可变区氨基酸序列。通过NCBIblast比对,显示扩增的VH和VL序列为小鼠抗体可变区序列,进一步利用Vbase2数据库对测序结果进行基因结构分析,定位了VH和VL上的高变区域互补决定区CDR和骨架区域FR,各包含3个CDR和4个FR区域,其中VH片段为360bp,编码120个氨基酸,属于IGHV3-2*02家族;VL片段为339bp,编码113个氨基酸,属于IGKV1-135*01家族。通过分子对接表明抗体重链上位点D108与病毒衣壳P蛋白上N195形成氢键,为关键氨基酸残基。食源性诺如病毒单克隆抗体VH和VL片段的成功扩增促进了基因工程抗体的发展及其在食品安全新型检测与控制技术的应用。     

贾第虫核糖核酸酶PRNA转录本3′端序列及其存在形式

目的确定贾第虫滋养体内核糖核酸酶P(RNase P)RNA 3′端序列及其存在形式。方法提取贾第虫滋养体总RNA,大肠埃希菌(E.coli)Poly(A)聚合酶加polyA尾后,进行反转录,扩增出加polyA尾后的cDNA,经PCR及测序进行鉴定,确定其3′端序列。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测RNase P-GLsR15共转录体与RNase PRNA成熟体的总表达量,两者之差即为RNase P RNA成熟体的表达量,确定贾第虫RNase P RNA的存在形式。结果 RNase P RNA 3′cDNA大小约300 nt,3′端序列与GLsR15 3′端序列一致;RNase P-GLsR15共转录体和RNaseP RNA成熟体的总表达量与RNase P-GLsR15共转录体表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论已成功克隆了RNase P RNA 3′端序列,证实RNase P RNA和GlsR15的共转录体即为RNase P RNA成熟体的存在形式。     

我国食源性诺如病毒GII.2[P2]型毒株基因组结构与衣壳蛋白功能研究

食源性诺如病毒（Norovirus）是引起全球食品安全事件的主要微生物病原,具有丰富的遗传多样性,基因型较复杂,近年来GII.2逐渐成为我国主要流行基因型之一。为了解食源性诺如病毒GII.2型变异特点,该研究以2015年在广州地区检出的GII.2[P2]型GZ2015-L335毒株为对象,对其基因组结构及衣壳蛋白功能进行了系统表征。该毒株基因全长为7 496 bp,在线基因分型结果表明其为GII.2[P2]基因型。通过克隆其衣壳蛋白VP1基因,借助杆状病毒表达系统获取重组VP1蛋白,并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化。SDS-PAGE和Western blot实验结果表明重组VP1蛋白分子量约为58 ku;透射电镜结果显示该蛋白可自组装形成直径约为30 nm的病毒样颗粒（Virus-like Particle,VLP）;ELISA结果显示该VLP与抗GII.2[P]衣壳P颗粒血清具有较高结合活性。此外,受体结合实验证实该VLP与A/B/O等分泌型及非分泌型唾液呈现出广泛的结合作用。该研究对GII.2[P2]型GZ2015-L335毒株基因组结构进行了系统分析,成功制备并表征了其病毒样颗粒,结果将为食源性诺如病毒的高效抗体研制及新型检测技术研发提供支撑。     

犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条的制备

目的制备犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用于标记抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体2D12制作金标垫,兔抗细粒棘球绦虫Ediag A864多克隆抗体标记检测线(T线),羊抗鼠Ig标记质控线(C线),制备胶体金试纸条,并进行特异性、敏感性、重复性及稳定性试验。用优化的胶体金检测试纸条对96份犬粪样品(36份参照阳性样,60份临床样品)进行检测。结果制备的犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条与犬蛔虫阳性粪及犬贾第虫阳性粪样品均无交叉反应;粪便稀释度为1∶4时仍可检出正确结果;3次检测参照阳性样本均为阳性;于不同温度(室温、4及37℃)下保存不同时间(1、2、3、4个月)的试纸条均可检出正确结果。96份犬粪便样品中,36份参照阳性样品检出率为97.2%(35/36),60份临床样品均为阴性。结论制备的试纸条具有良好的特异性及稳定性,可应用于临床样品检测及大规模流行病学调查。     

猪弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立一种检测猪血清中弓形虫循环抗原(circulating antigen,CAg)的双抗体夹心ELISA法。方法利用抗弓形虫表面抗原3(surface antigen 3,SAG3)的单克隆抗体Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗弓形虫SAG3的单克隆抗体Anti-A-SAG3-23作为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并对方法的捕获抗体(1∶400~1∶6 400倍比稀释)、检测抗体(1∶400~1∶12 800倍比稀释)、血清稀释度(1∶10~1∶80倍比稀释)及封闭液的种类(5%脱脂奶粉、10%胎牛血清、5%BSA、1%BSA)进行优化,同时验证该方法的敏感性、特异性及精密性。采用优化后的方法对广东和吉林地区的各94份猪血清样本进行检测。结果双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:捕获抗体Anti-A-SAG3-7及检测抗体HRP-Anti-A-SAG3-23稀释度均为1∶3 200,封闭液为1%BSA,血清稀释度为1∶80。该方法检测两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,灵敏度达1∶640,批内及批间的变异系数(CV)均11%。广东和吉林地区各94份样品的阳性率分别为20.2%(19/94)和11.7%(11/94)。结论该方法具有良好的特异性、敏感性及精密性,可用于猪弓形虫CAg的检测。     

2020~2021年广州市售牡蛎中GII型诺如病毒污染情况调查

滤食性牡蛎是食源性诺如病毒传播的重要食品媒介。为了解广州市售牡蛎中的诺如病毒污染水平与遗传多样性特点,合理评估消费风险,本研究于2020年6月至2021年5月期间,每月从当地水产市场随机采集牡蛎样本,采用实验室前期建立的蛋白酶K处理偶联聚乙二醇沉淀小体系法,包括荧光定量RT-PCR和巢式RT-PCR技术检测贝类中病毒的污染量以及基因型分布特点。结果共检测牡蛎110只,GII型诺如病毒阳性检出率为52.7%（58/110）,病毒污染含量范围为1.56×103~1.09×106 copies/g（消化腺）。其中,春夏季节（3~8月）牡蛎中诺如病毒的阳性率为35.7%（20/56）,低于在秋冬季节（9~2月）的阳性率70.4%（38/54）;但不同季节中检出的病毒含量无显著差异,分别为春季（2.69±1.46）×105 copies/g（消化腺）,夏季（1.97±2.16）×105 copies/g（消化腺）,秋季（6.91±6.16）×104 copies/g（消化腺）,冬季为（4.83±2.99）×104 copies/g（消化腺）。部分阳性样本测序分析后显示,除1份为GII.17基因型外,其余均为GII.4基因型（n=13）,与当地的临床流行基因型呈现一致性。本研究显示广州市售牡蛎中仍存在较高的诺如病毒污染水平,需要进一步加强病毒防控工作,尤其提醒消费者在食用牡蛎时需加工充分。