聚丙烯腈膜固定化海藻糖合成酶的研究

以聚丙烯腈膜(PAN)为载体,采用吸附法固定化海藻糖合成酶粗酶液。通过单因素法探讨最佳固定化条件,并分析固定化酶酶学性质。结果表明,最佳固定化条件为:pH 7.6、30℃、加酶量0.1 mg/cm~2条件下震荡吸附3 h;该条件下制备的固定化酶最适反应条件为:温度40℃、pH 7.4、初始麦芽糖底物浓度200 g/L。与游离酶相比,固定化酶热稳定性提高10℃、酸碱稳定性由pH 6.6～7.4扩展至pH 5.4～8.0;反应达到平衡时,反应液中海藻糖含量为50.9%,副产物葡萄糖含量为9.1%,较游离酶降低6个百分点,在目前已报道的固定化海藻糖合成酶催化反应中副产物含量最低;在40℃、pH 7.4、麦芽糖底物浓度200 g/L条件下,重复使用累计72 h后,固定化酶活仍保留在初始酶活的64.4%。     

重组乳酸克鲁维酵母产磷脂酶A2发酵条件的优化

利用重组乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）GG799表达磷脂酶A2,对其产酶发酵条件进行研究。采用单因素试验和正交试验对培养基及培养条件进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件。结果表明：最优培养基组成为葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、KH2PO4 3 g/L;最优培养条件为：发酵温度30 ℃、接种量2%（V/V）、初始pH?7.0、装液量90 mL/250 mL三角瓶、摇床转速220 r/min,在此条件下发酵培养,酶活力由（1.87±0.12）U提高到（5.35±0.27）U。     

Bacillus sp.CBB272脱枝酶的酶学性质

脱枝酶是淀粉加工过程中水解其1,6-糖苷键的水解酶,为淀粉彻底糖化所必需。作者从高温菌Bacillus sp.CBB272的培养液中,经过盐析、凝胶过滤层析、弱阴离子交换层析以及强阴离子交换层析联用的方法,纯化出一种新型脱枝酶。该酶在SDS-PAGE上的相对分子质量约为70 000,最适作用温度为70℃,最适作用pH为6.0。该酶在30~70℃、pH 4.5~9.0之间具有优良的稳定性。该酶在50℃和pH 6.0下水解支链淀粉的Km、Vmax分别为4.0324 mg/mL和0.1841 mg/(min.mL)。研究了不同金属离子对该酶活性和热稳定性的影响,发现Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对于该酶具有显著的激活效果,并且Ca2+对该酶的热稳定性具有很好的提升作用。     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。     

转运系统集成改造提升大肠杆菌胞外蛋氨酸积累

通过构建大肠杆菌(Escherichia coli)W3110 MetD吸收系统编码基因metI、metN、metQ单个缺损菌株,获得胞外蛋氨酸吸收速率最小菌株;游离及染色体整合表达YjeH和YeaS分泌系统编码基因yjeH和yeaS,研究增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对菌体胞外蛋氨酸积累和生物量的影响,为理性构建蛋氨酸高产菌株提供可行策略。实验结果表明,基因metI的缺损对胞外蛋氨酸的吸收影响最大,吸收速率降低了16.7%;游离表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸开始积累,胞外蛋氨酸最大积累量为0.21 g/L和0.18 g/L;染色体整合表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸的最大积累量为0.48 g/L和0.25 g/L,与游离表达相比提高了128%和38.9%。增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对于促进胞外蛋氨酸的积累效果显著,可以作为理性构建蛋氨酸高产菌株的策略。     

孢子预培养与形态控制提高柠檬酸生产效率

现有柠檬酸生产以黑曲霉孢子直接接种,种子延滞期长,发酵水平波动大。针对上述问题,提出孢子预培养策略缩短种子培养周期,通过颗粒物添加和振荡分散调控菌丝球形态均一性。研究获得了最适的孢子预培养条件：碳源为葡萄糖,氮源为玉米浆,Ca²⁺浓度为10 mmol/L,初始pH为5.0,温度为35℃,初始孢子浓度为0.8×10⁷ CFU/mL,在有氧条件下培养10 h。研究发现,孢子萌发前,颗粒物对孢子凝聚和菌丝球形态影响显著（P<0.05）,发芽孢子的凝聚对最终菌丝球形态起决定性作用。同时,小菌丝球会导致发酵产酸速率显著提高（P<0.05）。最后,在5 000 L规模工艺放大中,种子培养周期缩短12 h以上,成球率增加了18.3%,最大产酸速率提高了7.5%,发酵强度增加0.14 g/（L·h）,发酵周期缩短2 h,糖酸转化率升高1.2%。该研究对提升柠檬酸生产效率具有重要参考意义。     

酿酒酵母关键节点基因缺损对法尼烯合成的影响

以法尼烯为评价效应物,研究了缺损乙醇合成途径、甘油合成途径、胞质乙酰辅酶A转运途径和法尼基焦磷酸消耗支路关键基因对酿酒酵母WHE4菌株合成法尼烯的影响。通过CRISPR-cas9基因编辑技术,获得8株关键基因缺损菌株。结果表明,与WHE4菌株相比,缺损乙醇脱氢酶基因ADH3-6对乙醇和法尼烯产量没有影响;单独缺损甘油三磷酸脱氢酶基因GPD1和GPD2使甘油积累量分别降低了15%和34%,缺损半乳糖激酶基因GAL1、GAL7、GAL10下调了甲羟戊酸途径所有基因转录水平,它们的缺损均不能提高菌株的法尼烯产量;缺损香叶基香叶基焦磷酸合酶基因BTS1和二酰基甘油二磷酸磷酸酶基因DPP1,法尼烯产量提高了29%,在5 L发酵罐补料分批发酵,菌株WHE4-33(WHE4 Δbts1,Δdpp1)的法尼烯产量达到1 578.91 mg/L。该研究对甲羟戊酸途径上游和下游关键节点基因进行了缺损影响法尼烯合成研究,为构建酿酒酵母萜类化合物高效平台提供了参考价值。     

Thermobifida fusca异淀粉酶的作用机制分析

异淀粉酶可水解支链淀粉的α-1,6糖苷键,为淀粉彻底水解所必须。使用仪器分析方法推断此类酶作用机制的研究国内未见报道。Thermobifida fusca异淀粉酶经镍离子亲和色谱纯化,以玉米支链淀粉(maize amylopectin,AP)为底物,结合体积排阻色谱、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器及氢谱核磁共振等仪器分析方法研究其作用机制。结果表明:AP分子的相对分子质量为2 812 000,水解反应2 h后生成两类葡聚糖组分,相对分子质量分别为760 000和7.2 000,比例为1∶4.4;IAM随机水解支链淀粉分子的α-1,6糖苷键,并可切断带有2-3个葡萄糖残基的侧链分支点生成麦芽糖和麦芽三糖,而对α-1,4糖苷键无作用。完全水解支链淀粉生成具有α或β型还原末端的直链淀粉链或麦芽寡糖,产物聚合度(degree of polymerization,DP)主要在15~35之间。IAM作用机理的研究可为其工业化应用奠定基础。     

rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。