药学专业有机化学实验创新性研究

有机化学实验创新性研究,是有机化学实验教育发展的必然要求。为提高学生实验技能及实验创新能力,有机化学实验教学应对实验内容、教学方法、实验仪器及课程评价体系等进行创新性研究。     

金黄色葡萄球菌金属磷酸酶的遗传特征分析及功能鉴定

目的对金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)一种新型金属磷酸酶(metallophosphatase,MPP)SA1662进行遗传特征分析及生物学功能鉴定。方法从金葡菌基因组DNA中克隆SA1662基因,通过序列比对和构建进化树分析其遗传特征;构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,测定酶活性。应用同源重组技术构建SA1662基因缺失株,分析SA1662基因缺失对金葡菌生长、万古霉素敏感性、细菌自溶性和细菌生物菌膜形成的影响,探讨SA1662的生物学功能。结果 SA1662蛋白具有MPP类蛋白结构域,并含有特征性金属离子结合位点,与金葡菌和施维茨葡萄球菌中相关蛋白有更近的亲缘关系。该蛋白酶活性依赖于Mg^2+和Mn^2+,特别是Mg^2+。与野生型菌株相比,SA1662基因缺失后,细菌生长速度减慢,万古霉素敏感性、TritonX-100诱导下的细菌自溶性和细菌生物菌膜形成能力均下降。结论 SA1662蛋白为一种新型的金葡菌MPP,在细菌抗逆性中起着重要作用。     

万古霉素水凝胶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑菌效果评价

目的评价担载万古霉素的水凝胶缓释药剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的体外抑菌效果。方法制备担载万古霉素的水凝胶,确定其对MRSA的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),探讨其对MRSA的抑菌杀伤效应及生物菌膜生物量和细胞活性的影响。结果与未成胶的万古霉素相比,万古霉素水凝胶对MRSA的MIC(1μg/mL)和MBC(2μg/mL)分别各降低了1倍。对于MRSA的抑菌杀伤效应,万古霉素水凝胶呈缓慢释放并持续抑菌。万古霉素水凝胶对MRSA成熟生物菌膜生物量无显著影响,能增强对生物菌膜细胞活性的杀伤并减少万古霉素使用量,具有很好的抑菌杀菌效果。结论担载万古霉素水凝胶在减少用药剂量下与万古霉素抑菌效果相当,本研究为后续研发生物利用度好的新型缓释万古霉素药剂提供了参考。     

应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌

目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。