白鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶单域抗体文本库构建及淘选

鱼肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)在加工过程中可降解肌原纤维,引起鱼糜制品的凝胶劣化。一种新型特异性高的鲨源抗体——单域抗体(single-domain antib odies,sdAbs),能直接与抗原结合并抑制酶的活性。研究主要完成了针对MBSP单域抗体制备的前期工作:文本库建立及淘选过程,以克隆表达的MBSP为抗原免疫铰口鲨鱼(nurse shark,Ginglymostoma cirratum),构建鲨鱼单域抗体文本库,并从中淘选针对MBSP的特异性单域抗体噬菌粒,最终得到31个能与MBSP特异性结合的噬菌粒,为获得抗MBSP单域抗体鉴定了基础,以期抑制或消除MBSP的活性,解决现有鱼糜制品凝胶劣化的问题。     

鲨鱼单域抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达及热稳定性分析

酶标抗体的稳定性对酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)至关重要,但常规化学偶联方法制备的酶标抗体具有热稳定性不足的缺点,这限制了酶标抗体在ELISA中的应用。本研究利用基因工程技术克隆表达出碱性磷酸酶与特异性鲨鱼单域抗体的融合蛋白,并对融合蛋白的亲和力和热稳定性进行了研究。结果表明:在16 ℃下,0.05 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可实现融合蛋白的可溶性表达,表达出的融合蛋白分子量约为63 kDa,与目标抗原的亲和常数可达7.80×10-8 mol/L,具有良好的抗原结合能力;融合蛋白在58 ℃处理180 min后热稳定性良好,证明该融合蛋白可以作为ELISA检测中一种潜在的免疫诊断剂。