米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

为获得高活性的乳糖酶制剂,根据米曲霉乳糖酶基因序列以及宿主细胞乳酸克鲁维酵母GG799密码子的偏爱性,对米曲霉乳糖酶基因进行优化。将已优化的米曲霉乳糖酶lacA基因片段插入到乳酸克鲁维酵母GG799表达载体pKLAC1中,构建重组载体p KLAC1-lacA,用电脉冲法将SacⅡ酶线性化的重组质粒转入乳酸克鲁维酵母GG799中。经过5 mmol/L酵母碳基础培养基(yeast carbon base,YCB)活性筛选,全细胞聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌株lacA-1。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和薄层层析分析(thin-layer chromatography,TLC),该重组菌株可胞外分泌乳糖酶,并具有生物活性。摇瓶发酵培养120 h,酶活力最高达到120.65 U/mL。本研究成功地将米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799中表达,获得的重组菌株lacA-1可胞外分泌的乳糖酶并有较高的乳糖酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母GG799表达系统规模化生产乳糖酶奠定基础。     

布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化

为实现布拉酵母高密度培养,对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素,并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network,ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型,利用遗传算法（genetic algorithm,GA）进行全局寻优。结果表明,ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力,更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养,菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L,比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养,流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L,菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。     

复合壁材布拉酵母微胶囊的制备

为提高布拉酵母对环境的耐受能力，采用复合壁材制备布拉酵母微胶囊。利用正交法考察了变性淀粉、β-环糊精和明胶3种材料的比例对微胶囊有效活菌数的影响。在此基础上，通过单因素法和正交实验对复合壁材浓度、进风温度、通气量和上料速度等工艺参数进行优化，观察微胶囊形态并考察对模拟消化液的耐受能力。结果表明：布拉酵母质量分数为10%时，变性淀粉、β-环糊精和明胶的最佳配比为6∶3∶5。喷雾干燥最佳工艺参数为：复合壁材质量分数16%、进风温度80℃、通气量550L/min、上料速度15mL/min。各因素对喷雾工艺的影响程度为：进风温度>复合壁材浓度>上料速度>通气量。采用最优条件制备的布拉酵母微胶囊呈球形，表面紧密无裂缝，平均大小为138.65μm，具有耐受能力强和体内缓释的特点。研究结果为布拉酵母微胶囊的工业化生产奠定了基础。