基于葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的NADPH高效再生

目的:构建辅酶NADPH高效再生的基因工程菌,获得辅酶NADPH高效再生的最佳工艺条件。方法:利用基因工程技术将辅酶NADPH再生关键酶的基因glk和zwf导入到大肠杆菌BL21中,实现辅酶NADPH循环高效再生,并优化辅酶NADPH再生的工艺条件。结果:成功构建了含有辅酶NADPH再生关键酶两个基因的重组大肠杆菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf;通过正交设计优化试验,获得重组工程菌株产辅酶NADPH的最佳工艺条件是:诱导温度20 ℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度0.25 mmol/L、接种量1.5%、装液量100 mL/250 mL。在此条件下进行1 L发酵摇瓶诱导培养48 h,辅酶NADPH产量高达151.79 μmol/L。结论:研究结果为辅酶NADPH循环再生提供了良好的理论基础。     

产肌醇的植物乳杆菌ZJ2868菌粉制备工艺

为研究产肌醇的植物乳杆菌ZJ2868的菌粉制备工艺,以菌体的存活率为指标,研究植物乳杆菌ZJ2868菌粉制备过程中的离心转速、保护剂配方、菌粉复溶条件和菌粉贮藏稳定性。结果:菌体收集的最佳离心条件:4 000 r/min、10 min。最佳冻干保护剂配方:谷氨酸钠11%、脱脂乳14%和海藻糖9.0%。最佳复溶条件:在原保护介质中复溶30 min。最佳贮藏温度:4℃。制得植物乳杆菌ZJ2868冻干菌粉的活菌数为2.90×109CFU/mL,存活率达85.4%,水分含量3.7%。本研究结果为植物乳杆菌菌粉的制备提供了试验依据。     

蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶发酵条件的优化

目的:优化蜡样芽孢杆菌发酵生产新型中性蛋白酶的培养条件。方法:采用Plackett-Burman试验设计,筛选影响蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶酶活力的关键因子;通过Box-Behnken响应面试验设计获得新型中性蛋白酶发酵的最佳工艺条件。结果:筛选出影响蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶的主要因子为葡萄糖、蛋白胨和pH值。获得的最优化发酵培养基组成和培养条件:葡萄糖35 g/L,蛋白40.38 g/L,氯化钠15 g/L,硫酸镁1.5 g/L,Tween-8010 g/L,装液量50 mL/250 mL,pH 7.15,菌龄12 h,发酵时间36 h。在上述条件下,蜡样芽孢杆菌发酵生产新型中性蛋白酶的酶活力高达696.51 U/mL,是未优化前的1.93倍。结论:研究结果为新型中性蛋白酶的产业化生产和应用提供了良好基础。     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质

目的:研究大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质。方法:首先采用PCR技术克隆编码大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因gadA,并将该基因克隆至载体pET-28a(+)中,形成重组质粒pET28a-gadA;然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA。进一步采用Ni~(2+)亲和层析色谱分离纯化谷氨酸脱羧酶A,研究其酶学性质。结果:经PCR和双酶切鉴定,重组质粒pET28a-gadA构建成功。SDS-PAGE分析表明Ni~(2+)亲和层析纯化后得到电泳纯级谷氨酸脱羧酶A,其比活力为19 U/mg,得率为12.8%。在pH 4.5时,谷氨酸脱羧酶A的酶活力最高。该酶的最适温度为50℃,且在40℃时有较高的热稳定性,70℃时热稳定性较差,酶活力仅为初始酶活的17.9%。Cu~(2+)对该酶的酶活力有较强的抑制作用,Ba~(2+)、Co~(2+)和Mg~(2+)对其酶活力影响不大,Ca~(2+)能显著增加该酶的酶活力。结论:研究结果为深入理解谷氨酸脱羧酶A的酶学性质及其γ-氨基丁酸的制备提供了试验基础。