In Vitro Characterization of Neutralizing Hen Antibodies to Coxsackievirus A16

Coxsackievirus A16 (CA16) is one of the major causative agents of hand, foot, and mouth disease (HFMD). Children aged <5 years are the most affected by CA16 HFMD globally. Although clinical symptoms of CA16 infections are usually mild, severe complications, such as aseptic meningitis or even death, have been recorded. Currently, no vaccine or antiviral therapy for CA16 infection exists. Single-chain variable fragment (scFv) antibodies significantly inhibit viral infection and could be a potential treatment for controlling the infection. In this study, scFv phage display libraries were constructed from splenocytes of a laying hen immunized with CA16-infected lysate. The pComb3X vector containing the scFv genes was introduced into ER2738 Escherichia coli and rescued by helper phages to express scFv molecules. After screening with five cycles of bio-panning, an effective scFv antibody showing favorable binding activity to proteins in CA16-infected lysate on ELISA plates was selected. Importantly, the selected scFv clone showed a neutralizing capability against the CA16 virus and cross-reacted with viral proteins in EV71-infected lysate. Intriguingly, polyclonal IgY antibody not only showed binding specificity against proteins in CA16-infected lysate but also showed significant neutralization activities. Nevertheless, IgY-binding protein did not cross-react with proteins in EV71-infected lysate. These results suggest that the IgY- and scFv-binding protein antibodies provide protection against CA16 viral infection in in vitro assays and may be potential candidates for treating CA16 infection in vulnerable young children.     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

CA16疫苗及其相关研究进展

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)为严重影响婴幼儿健康的传染病。肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)与柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起HFMD的主要病原体之一,曾引起包括中国等多个国家或地区HFMD的流行或暴发。疫苗是控制传染病流行的主要手段。EV71疫苗上市后,CA16疫苗和EV71/CA16联合疫苗及其相关研究已成为人们关注的热点。本文对CA16疫苗研发及其相关研究的最新进展作一综述。     

柯萨奇病毒B4对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响

目的研究柯萨奇病毒B4(CVB4/jlu06株)对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响,探讨柯萨奇病毒感染与I型糖尿病(T1D)之间的关系。方法CVB4/jlu06毒株腹腔注射感染ICR小鼠,感染后不同时间取小鼠胰腺组织,进行病理及免疫组化分析,并测定糖耐量。结果随着感染时间延长,小鼠胰腺组织损害加重。免疫组化染色在胰腺组织中检测到大量病毒抗原。感染后117d,病毒感染小鼠糖耐量水平比未感染对照组明显降低,且差异有显著意义。结论CVB4/jlu06毒株感染可引起ICR小鼠糖尿病样症状,其感染可能与T1D的发生密切相关。     

柯萨奇病毒A组16型G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学

目的探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学。方法常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1 MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同温度和pH维持液中进行培养,每2 h收样1次至第24 h,以48 h收样作为对照样,微量滴定法检测病毒滴度,并绘制增殖动力学曲线。结果 G20株病毒在Vero及KMB-17细胞中传代适应后,均可导致细胞病变。G20株病毒在此两种细胞中培养,pH 6.0、pH 6.5时,不同培养温度下,病毒基本不增殖;pH 7.5与pH 7.0的病毒增殖基本一致,增殖速度随温度呈现37℃>35℃>33℃的趋势;在33℃～37℃、pH 7.0～8.0时,病毒均有不同程度的增殖;在41℃、各pH条件下,病毒增殖均明显受到限制。结论病毒在此两种细胞中,37℃,pH 7.5培养条件下,增殖速度及滴度均较理想。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗候选株减毒特性的分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)减毒活疫苗候选株进行初步分析,为CA16减毒活疫苗的研制奠定基础。方法将两株CA16疫苗候选株(KM168和KM154)进行低温连续传代减毒,对不同代次病毒进行减毒特性的分析。将候选株病毒收获液免疫ICR乳鼠(颅内注射)及ICR成鼠(腹腔注射),分别评价减毒疫苗候选株的毒力、免疫原性以及乳鼠作为减毒活疫苗残余毒力评价动物模型的可行性;对病毒进行VP1片段的测序,分析遗传稳定性。结果两个候选株经低温连续传代后,均具有稳定的生长特性及良好的免疫原性,感染性滴度均保持在约7.0 Lg CCID50/ml,免疫小鼠后抗体阳转率达100%,最高GMT约1∶30。乳鼠及成鼠感染病毒后,在大部分组织中能检测到CA16病毒;KM154株在第12代后未对乳鼠产生临床致病性及致死率,病理检测结果主要表现为少量炎性细胞集结,无明显组织损伤,随着传代增加,组织损伤明显减少。两个候选株经低温连续传代后,能保证VP1片段的遗传稳定性。结论低温连续传代可使CA16的毒力明显降低,有望筛选出减毒活疫苗的候选株;1~2日龄ICR乳鼠可以作为CA16减毒活疫苗的候选株毒力评价的动物模型。     

超高压用于病毒减毒及灭活的研究

目的采用超高压的方法处理流感病毒FM1株和柯萨奇病毒B3(CVB3/MKP),并确定最适灭活条件。方法以不同的压力和时间处理FM1和CVB3/MKP病毒,并检测处理后病毒毒力及对ICR小鼠的感染性。结果FM1和CVB3/MKP病毒的灭活条件分别为300 MPa,2.5 h和700 MPa,0.5 h。感染小鼠组织病理切片显示,超高压组小鼠的肺和心肌组织有少量炎细胞浸润,接近正常肺组织。超高压处理FM1组小鼠的肺指数与病毒对照组比较,差异有显著意义。结论超高压的方法可用于流感病毒FM1株和柯萨奇病毒B3(CVB3/MKP)的减毒或灭活。     

柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

Steady State Disinfection of Water By Ozone and sonozone

Steady State laboratory flow equipment is used to disinfect Coxsackievirus, E. coli, S.lutea and the plate count flora of natural water, by means of dissolved and gaseous ozone, alone and simultaneous with ultrasound (sonozone).Distilled, surface and waste water are used as media. By ozonation, a three stage inactivation kinetics is observed. Inactivation of 3 & 4 decades is obtained, at 10–95% lower ozone concentrations, and by 57–96% lower gaseous ozone dosage by the sonozonation process compared to ozonation alone. Ultrasound increases the gas–liquid ozone transfer, and decomposes the dissolved ozone. It also disaggregates the viable microbial units.