老白干酒曲中酵母菌多样性分析

采用微生物分离培养与分子鉴定相结合的方法,在对酒曲中的酵母菌进行分离、纯化和形态学鉴定基础上,进行菌株核糖体26S rDNA聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术结合的分子鉴定。并采用非培养方法,直接提取酒曲中的总DNA进行聚合酶链式反应扩增、电泳和切胶与回收,通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）法鉴定酵母菌。结果表明,采用培养方式分离到57?株6?种不同形态的酵母菌,经鉴定为5?种分子类型,分别为奥默毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）。经PCR-DGGE法鉴定得到10 株酵母菌,分别为W. anomalus、Wickerhamomyces sp.、T. asahii、热带假丝酵母（Candida tropicalis）和Candida sp.各1 株,Hyphopichia burtonii 2?株,另有uncultured Saccharomycopsis 3?株。培养与非培养两种方式共鉴定得到10 株酵母菌,分别属于8?个属,包括P. kudriavzevii、C. lusitaniae、W. anomalus、R. mucilaginosa、T. asahii、uncultured Saccharomycopsis、H. burtonii、Wickerhamomyces sp.、C. tropicalis、Candida sp.,该研究结果可为进一步研究酒曲的发酵能力提供参考。     

中高温大曲中酵母菌的分离及其在小曲酒中发酵性能初探

从中高温大曲中分离出酵母菌,通过制作米曲酿造小曲酒初步探究了大曲中的酵母菌在小曲酒中的发酵能力。采用稀释平板涂布法从大曲中分离纯化出酵母菌,经形态学和分子生物学鉴定确定了酵母菌的种属,并优化了米曲制作过程中原料的含水量和制曲时间。结果表明,从中高温大曲中共分离出4株酵母菌(Y1、Y2、Y3和Y4),经鉴定Y1为异常威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus),Y2为东方假丝酵母(Candida odintsovae),Y3和Y4为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。米曲的最佳制作工艺为在原料含水量为46%(质量分数)下培养7 d。以高粱为原料,米曲和糖化酶为糖化发酵剂发酵产酒发现,4种酵母的产酒能力依次为酿酒酵母Y3酿酒酵母Y4异常威克汉逊酵母Y1东方假丝酵母Y2。该研究为提高小曲酒质量和开发大曲中微生物资源提供了一条有效途径。     

基于高通量测序技术对茅台镇酱香白酒主酿区域酵母菌群结构多样性的解析

对茅台镇酱香白酒酿造的7个不同主酿区域的酿造环境及生产用大曲的酵母菌群多样性结构运用高通量测序技术进行解析,共检出53种酵母属,大曲中共检出33个属,环境中共检出52种属。大曲中的优势酵母属为Saccharomycopsis和Wickerhamomyces,环境中的优势酵母属为Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Debaryomyces和Cryptococcus。环境和大曲之间的酵母属群落结构差异性显著,环境中的酵母群落结构丰富度高于大曲。环境是酱香白酒酿造过程生产大曲中的酵母属的主要来源,大曲中有96.97%的酵母属来自于环境。Gibellulopsis、Filobasidium、Kuraishia、Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Cystofilobasidium、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Yamadazyma、Eremothecium、Ballistisporomyces、Aessosporon和Kurtzmanomyces为首次在酱香白酒酿造中检出并报道的酵母属。     

茅台镇酱香型白酒酿造大曲及环境中可培养细菌多样性及功能分析

通过传统微生物分离筛选与分子鉴定方法,对茅台镇酱香型白酒连续7轮次的大曲和酿造环境样品的可培养细菌进行研究,从样品中共分离得1 370株细菌,归属于5个门、28个属和59种细菌。所分离菌株中Bacillus solani、B.gottheilii、B.paralicheniformis、Brevibacillus agri、Pseudomonas xanthomarina、Lelliottia nimipressuralis、Aureimonas sp.、 Sphingobacterium daejeonense、Oceanobacillus indicireducens、Cronobacter sakazakii、Mixta gaviniae、Paraburkholderiafungorum、Viridibabacillus arvi和Atlantibacter hermannii在酱香型白酒酿造中鲜有检出并报道。细菌的分布频率和优势度分析表明,Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus为大曲中的核心可培养细菌,Bacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes为环境中的核心可培养细菌,Bacillus、Staphylococcus和Micrococcus为大曲和环境样品中共有的可培养核心细菌。各轮次大曲与环境样品中的细菌菌群多样性结构存在差异,但其主要功能细菌菌群结构及其演替基本保持一致。大曲和环境样品中的优势细菌均可代谢丰富酶系的功能,且具有较强的金属离子吸附降解功能。本研究可为茅台镇酱香白酒酿造及其他地域酱香型白酒酿造微生物的研究提供基础。     

高产乙酸乙酯酵母菌的筛选及其在清香型小曲白酒生产中的应用

该研究利用WL营养琼脂培养基从浓香型大曲中分离纯化酵母菌,采用形态学观察和分子生物学技术对其进行鉴定,经过高粱汁培养基发酵初筛、高粱固态培养基发酵复筛,获得高产乙酸乙酯的酵母菌,并将其应用于清香型小曲白酒工业生产。结果表明,从浓香型大曲中分离得到2株酵母菌,编号为Y87和Y88,经鉴定分别为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,其中菌株Y87乙酸乙酯产量最高,高粱汁液态发酵和高粱固态发酵乙酸乙酯产量分别达到1.13 g/L、1.14 g/L,菌株Y87强化曲酿造的白酒乙酸乙酯含量提高36.6%,杂醇含量降低7.1%,正丙醇含量降低16.1%,感官评分为90.7分,该白酒具有清香型小曲白酒的典型特征,入口醇甜,清香纯正,说明菌株Y87可显著提高小曲白酒的品质。     

基于26S rRNA D1/D2区序列对不同时期大曲中酵母菌的分离与鉴定

利用大曲作为糖化发酵剂是中国传统白酒主要的工艺特点之一。大曲中的微生物组成十分丰富包括各种种类的霉菌、酵母以及细菌,这些复杂的微生物体系为白酒的发酵提供了必要的微生物、酶以及风味物质。酵母菌作为所有酒类发酵生产中必不可少的微生物,在大曲的生产过程中也起到了很重要的作用。为了探究大曲中功能微生物,本文对不同时期大曲中分离的酵母菌采用26S rRNA D1/D2区序列进行分析比对,共分离鉴定了260株酵母菌,分属于22个种。主要为Wickerhamomyces anomalus,Candida orthopsilosis,Meyerozyma guilliermondii,Pichia caribbica,Saccharomycopsis fibμLigera,Cryptococcus neoformans var.grubii,Clavispora lusitaniae,Saccharomyces cerevisiae等。对序列比对的结果进行了单链构像多样性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析,确定了它们的种间差异,并构建了M-L系统树。根据这些分离鉴定的结果初步探究出大曲生产过程中不同时期酵母菌的组成和变化规律。这些结果为进一步研究中国传统白酒的酿造微生物奠定了一定的基础。     

四川浓香型大曲生产中酵母菌、芽孢杆菌与工艺指标的关联性分析

研究四川浓香型白酒制曲过程中酵母菌、芽孢杆菌类群以及工艺指标(理化因子和质量指标)的动态变化,分析大曲中酵母菌和芽孢杆菌多样性及其与工艺指标的关系。根据QB/T 42572011《酿酒大曲通用分析方法》,监测制曲过程中的工艺指标,同时采用纯培养技术对11个样品中的酵母菌和芽孢杆菌进行选择性分离。纯培养获得的194株酵母菌,归属于子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的9个属,其中7个属都集中在酵母菌目(Saccharomycetales);148株芽孢杆菌被鉴定为8个种,其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为优势菌。另外,研究也验证了四川浓香型大曲在生产周期第90~180天为最佳使用期的生产经验,随着贮存期的继续延长,大曲品质出现大幅下降。冗余分析显示,温度、水分、酸度和淀粉含量与两大微生物类群以负相关为主,3种酵母菌(Kazachstania exigua、Candida tropicalis和Wickerhamomyces anomalus)和3种芽孢杆菌(B.subtilis、B.horneckiae和B.megaterium)是影响大曲质量的关键微生物类群。四川浓香型大曲生产过程中具有丰富的酵母菌与芽孢杆菌多样性且发生动态变化,它们既受到制曲理化因子的调控,也影响大曲品质。     

酱香白酒酿造过程中产多元醇功能酵母的筛选

为了解酱香型白酒酿造过程中产多元醇酵母的种类和功能,以酱香型白酒大曲和酒醅中分离的酵母为研究对象,采用薄层层析法和高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）对具有产多元醇功能的酵母进行筛选和多元醇定性、定量分析。实验结果显示,从142株酵母菌中筛选出5株具有产多元醇功能的酵母菌娄德酵母（Lodderomyces elongisporus） FBKL2.0073、库得毕赤酵母（Pichia kudriavzevii） FBKL2.0008、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0310、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0307和Trichosporonoides sp. FBKL2.0315,其中前4株菌都能产D-阿拉伯糖醇,L. elongisporus FBKL2.0073菌株产多元醇的总量最多,为（9.87±0.85） g/L。     

酱香型白酒酿造微生态中酵母菌的研究进展

酱香型白酒是我国传统发酵饮品,具有酱香突出、酒体醇厚、空杯留香等特点,其独特的品质与酿酒微生态中的微生物息息相关,其中酵母菌是酱香型白酒酿造微生物家族中重要的三大菌群之一,对酱香型白酒的出酒率、酒体的风味及质量有着极其重要的影响。该文概述酱香型白酒酿造过程中酵母菌的多样性、菌群结构及其主要功能,从酵母菌代谢产物的角度阐释酱香型白酒发酵的内在机理以及呈香机制,介绍功能酵母在实际生产中对乙醇产率及酱香风格特征的贡献,并指出对高温大曲中酵母菌的研究尚有不足、酵母菌与其他酿造微生物或环境之间的关联性研究较少等问题,为酱香型白酒科学生产提供了参考。     

牛栏山二锅头酵母菌多样性研究及其代谢产物分析

从牛栏山清香型白酒发酵酒醅中共获得120株酵母菌,对其26S rDNA D1/D2区测序分析,对分离酵母菌进行鉴定,并分别以 高粱和酒醅作为酵母培养基,分析不同种酵母菌的代谢产物。结果表明,共分离鉴定得到9株酵母菌,在高粱培养基中,库德里阿兹氏 毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）乙酸乙酯产量较高,分别为969.0 mg/L和541.4 mg/L, 9种蒸馏液中正丙醇、异丁醇、异戊醇含量均高于对照组,尼泊尔德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）发酵产乙醛能力最高（58 mg/L）; 在酒醅培养基中,9株酵母菌代谢产物中共检测到24种酯、9种醇、5种酸、2种酮、2种醛、2种酚及1种呋喃,其中W. anomalus产乙酸乙 酯能力最强4 494.27 μg/L,P. kudriavzevii具有较强的产乙酸乙酯、苯乙醇、异丁醇及异戊醇能力,分别为546.21 μg/L、724.96 μg/L、 31.56 μg/L及142.52 μg/L,膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）产乙酸能力最强（498.56 μg/L）。     

酱香型白酒核心产区大曲中霉菌的分离及鉴定

以贵州遵义地区的酱香大曲为研究材料,采用可培养的技术手段,分离鉴定酱香大曲中的霉菌,通过菌落形态和细胞形态特征,结合霉菌ITS基因序列同源性对比结果,共分离鉴定出10个属的霉菌共55株。最终确定酱香型大曲霉菌的主体类群组成以Aspergillus sp.、Rhizopus sp.、Lichtheimia sp.,Rhizomucor sp.、Monascus sp.、Eurotium sp.、Paecilomyces sp.、Mucor sp.为重要功能性菌群的群落体系。其中Aspergillus flavus、Lichtheimia ramose、Lichtheimia corymbifera、Eurotium amstelodami四种霉菌在5个大曲样品中均分离到,Mucor circinelloides存在于除MF01的其他四个样品中,Paecilomyces variotii存在于除MF02的其他四个样品中;而Penicillium commune仅在样品MF02中被鉴定出来,Aspergillus tamarii、Penicillium griseofulvum、Thermoascus crustaceus这三种霉菌仅在样品MF03中被鉴定出来,说明即使在酱香型白酒核心产区,不同酒厂大曲霉菌的种类存在差异性。     

青稞酒大曲微生物的分离鉴定及可培养微生物变化规律分析

采用传统微生物分离技术结合PCR测序,分析青稞酒大曲中的微生物数量关系和多样性组成。从青稞酒制曲及储存期样本中分离出酵母菌37株,细菌22株,霉菌13株,经鉴定为Saccharomycopsis fibuligera、Wickerhamomyces anomalus、Bacillus subtilis、Staphylococcus vitulinus、Rhizomucor pusillus、Pantoea等,可培养检测结果表明,青稞酒大曲中细菌数量最多,3～4 d达到最高后基本趋于稳定,后期略有减少,酵母菌数量5 d达到最高,后期稳定,霉菌数量最少数量增加缓慢。     

食品中酵母菌的分离鉴定及其致腐能力

参照食品安全GB 4789.15-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中酵母菌的检测方法,从水果、蜂蜜中分离筛选酵母菌并根据其26S rDNA D1/D2区序列进行鉴定。从蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分离得到3 株固囊酵母（Citeromyces matritensis）、3 株异常威客汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、12 株季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、1 株长孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）、2 株葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和1 株海洋酵母菌（Metschnikowiareukaufii）。将每种酵母菌接种于苹果、油桃和香蕉中与空白对照进行对比,以食品腐烂的速率来判断酵母菌的腐败能力,确定了W. anomalus和 C. matritensis是上述3 种水果中主要的腐败酵母菌,除此之外,M. reukaufii对油桃有较强的腐败作用,M. guilliermondii对香蕉的腐败效果明显。食品工业中加强对上述这些腐败酵母菌的检测与控制,可以更好地防止腐败酵母对于食品工业造成的危害。     

高温大曲中产香酵母的筛选及特征香气分析

从高温大曲中经过分离纯化、液态发酵产香初筛和固态发酵产香复筛,获得两株产香较好的酵母菌株Y3和Y5,使用顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS）对Y3和Y5的固态发酵产物进行检测分析,分别检出43种和37种挥发性香气化合物。Y3固态发酵产物主要香气成分为β-苯乙醇、异戊醇、异戊酸、丁酸乙酯;Y5固态发酵产物主要香气成分为β-苯乙醇、4-乙烯基愈创木酚、异戊酸。经过形态学、生理生化试验以及分子鉴定确定Y3为扣囊复膜酵母（Scchromycopsis fibuliger）,Y5为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。将Y3、Y5等比例混合添加至酱香型白酒酒醅中模拟生产发酵,蒸馏酒样使用气相色谱仪（gas chromatograph,GC）测定骨架成分。结果表明,Y3和Y5能够显著提升酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量。     

赊店老酒大曲中可培养真菌的分离和鉴定

该研究采用传统分离培养方法,对赊店老酒大曲中的真菌进行分离纯化并通过形态学观察及分子生物学鉴定确定所获菌株的分类地位。结果表明,老酒大曲样品中共计分离得到45株酵母菌和103株霉菌。共鉴定出6株酵母菌,分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）及光滑假丝酵母（Candida glabrata）;酵母的优势菌属为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（相对含量71%）、光滑假丝酵母属（Candida glabrata）（相对含量11%）。共鉴定出4个霉菌属,分别为根霉属（Rhizopus）、横梗霉属（Lichtheimia）、曲霉属（Aspergillus）和毛霉属（Mucor）;霉菌的优势菌属为根霉属（Rhizopus）（相对含量37%）、横梗霉属（Lichtheimia）（相对含量33%）。     

酱香型白酒高温大曲发酵过程中真菌多样性研究

基于传统可培养方法和单分子实时测序技术对酱香型白酒仿生机制曲和传统人工曲发酵过程真菌群落组成及特征进行了研究。结果表明Wicherhanmomyces anomalus,Pichia kudriavzevii,Candida tropicalis,Kodamaea ohmeri,Kazachstania humilis,Kluveromyces marxianus和Aspergillus属丝状真菌可以同时被两种方法检出,从曲坯成型入仓到发酵结束出仓,真菌多样性呈现逐渐降低的趋势。同时,与二代高通量测序结果相比,单分子实时测序技术在种水平上更适合于小类真菌多样性的鉴定。此外,高温大曲多数优势真菌属之间呈显著正相关调节机制,其中包括55个真菌属呈现显著正相关,6个真菌属呈显著负相关。本研究揭示了酱香型白酒高温大曲制作过程真菌群落组成及其特征,旨在为挖掘高温大曲中功能微生物及阐明高温大曲发酵机理奠定理论基础。     

贵州产地刺梨果酒产酒精酵母的筛选及其发酵性能研究

选取贵州遵义、荔波、六盘水、都匀4个地区的新鲜刺梨为实验材料,采用孟加拉红培养基分离纯化、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）培养基初筛产酒精能力强的酵母菌株,结合杜氏小管产气实验和耐受性实验复筛发酵性能优良的酵母菌株,然后采用复筛菌株酿造刺梨果酒,测定果酒理化指标,最后基于26S rDNA基因序列对复筛菌株进行分子生物学鉴定。结果表明,从刺梨中共分离得到35株酵母菌,并从中复筛3株优良酵母,编号分别为GL14、GP21、GP24,其产气快、凝聚性强,可耐受50%葡萄糖、18%vol乙醇、300 mg/L SO2、pH=2环境。菌株GL14、GP24发酵酿制的刺梨果酒在澄清度及酒精度方面优于菌株GP21,而菌株GP21在刺梨果酒的香气上更优,说明3株酵母菌均具有刺梨果酒酿造潜力。经鉴定,菌株GL14为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）,菌株GP21、GP24为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。     

羊羔美酒大曲中酵母菌多样性及分子鉴定

目的：分离和鉴定羊羔美酒大曲中的酵母菌,探寻酵母菌群多样性组成,为深入研究羊羔美酒的风味特征奠定基础。方法：对羊羔美酒大曲实施多点采样、混合研磨、无菌水梯度稀释、平板画线分离、挑取酵母菌单菌落。酵母菌的形态鉴定采取菌落特征和显微细胞特征结合的方法,分子鉴定采用5.8S rDNA-ITS区域限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析及序列分析法。结果：从羊羔美酒大曲中共分离出474 株酵母菌,传统形态学鉴定为14 种形态类型,经5.8S rDNA-ITS区域RFLP分析法区分为6 种分子类型。经基因序列分析,将其鉴定为分属于6 个属的6 种酵母菌,分别为：异常毕赤酵母（Pichia anomala）、酿酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）、黏质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）。结论：羊羔美酒大曲中酵母菌多样性丰富,除酿酒酵母外,还含有多种酵母菌辅助代谢产生各种风味物质,其中酿酒酵母为主要优势菌群。     

基于高通量测序技术解析高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构

采用高通量测序技术对白酒高温大曲和中高温大曲进行分析,比较2种大曲真菌群落结构的差异。结果表明,霉菌是构成高温大曲的主要真菌,其中疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)和Wallemia sp.为高温大曲所特有,分别占总水平的80. 49%和4. 25%;酵母菌是构成中高温大曲的主要真菌,中高温大曲中霉菌含量仅有1/4左右,东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)为中高温大曲所特有,分别占总水平的38. 22%、25. 66%、21. 40%、3. 82%、2. 75%、1. 5%和1. 29%。此外,Aspergillus intermedius在高温大曲和中高温大曲中的含量分别为10. 95%和3. 45%。该研究初步揭示了高温大曲和中高温大曲真菌群落结构的差异,为大曲在酿造生产中的应用提供参考。     

水塔老陈醋大曲酵母的分离鉴定及产乙醇和乙酸乙酯特性

采用传统分离培养方法,从水塔老陈醋大曲中分离纯化出21株酵母菌,利用26S r DNA D1/D2序列分析方法结合形态学特征,对分离纯化的酵母菌进行鉴定,并用其发酵糯米糖化液,用静态顶空-气质联用的方法测定发酵后乙醇和乙酸乙酯的含量。结果发现:21株酵母菌鉴定结果为2株弗比恩酵母(Cyberlindnera fabianii),8株扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、6株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、3株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、2株东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)。21株菌株发酵后产物乙醇和乙酸乙酯的含量存在较大差别,其中产生乙酸乙酯和乙醇最多的菌株分别为异常威克汉姆酵母m12(含量为4.4415 g/L)和扣囊复膜酵母q25(含量为48.577 g/L);产生最少的则分别为扣囊复膜酵母q6(含量为0.0037 g/L)和东方伊萨酵母q12(含量为11.4555 g/L)。提示老陈醋大曲中不同种类的酵母菌在发酵中对乙醇和乙酸乙酯具有不同的贡献。