荧光定量免疫层析法测定鸡肉和牛奶中的氯霉素

目的建立一种荧光定量免疫层析法测定动物源性食品鸡肉与牛奶中氯霉素残留的分析方法。方法将氯霉素鼠单克隆抗体与羧基化铕微球进行偶联标记。经过荧光微球活化、探针偶联等一系列条件优化确定最佳反应体系条件,根据纸条测试线(T线)信号值与质控线(C线)信号值的比值(T/C)和样本中氯霉素浓度建立定量标准曲线。针对鸡肉和牛奶样品,对荧光免疫层析检测方法的灵敏度、准确度和精密度等进行评价,并与液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)标准仪器分析方法进行比较。结果本研究建立的荧光免疫层析检测方法对鸡肉和牛奶中氯霉素残留的检出限分别为0.041μg/kg和0.040μg/kg,定量限分别为0.079和0.100μg/kg,添加回收率在76.26%～112.92%之间,变异系数均小于15%。结论本研究建立的荧光定量免疫层析方法灵敏度高、稳定性好,且与使用仪器方法得到的检测结果一致性较高,适用于鸡肉和牛奶中氯霉素残留的现场快速检测。     

荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白

目的研究用荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中的酪蛋白。方法本文以酪蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备抗酪蛋白的多克隆抗体,将纯化后的多克隆抗体通过EDC介导法与荧光微球进行偶联,将滤纸、样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组装成试纸条,用此荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中的酪蛋白。结果试纸条在25 min内就能判定结果,最低检测限为100 ng/mL,该方法与BSA、OVA均无交叉反应,具有很好的特异性。检测酪蛋白浓度为100.0、500.0、1000.0 ng/mL的样品,试纸条的批内回收率分别为(89.03±5.2)%、(93.47±6.9)%和(91.2±7.8)%,批间回收率分别为(87.69±6.2)%、(92.73±8.3)%、(89.82±8.5)%。结论初步建立了一种快速、方便、高灵敏度的荧光微球免疫层析方法用以检测牛乳制品中的过敏原——酪蛋白。     

玉米赤霉烯酮时间分辨荧光试纸条的制备及特性研究（网络首发、推荐阅读）

研究制备一种基于时间分辨荧光免疫层析法的玉米赤霉烯酮（ZEN）快速定量检测试纸条。采用铕纳米微球作为荧光探针,标记抗ZEN的单克隆抗体,应用竞争抑制原理建立免疫层析定量方法并对其进行方法学考核。结果表明：ZEN荧光试纸条的灵敏度为0.1 ng/mL,线性范围为0.1~5.0 ng/mL,玉米、小麦阴性样品的加标回收率在93.45%~112.20%之间,对于同一个样品5次重复测定的变异系数小于15%。ZEN快速定量检测试纸条具有灵敏度高、反应时间短、准确定量、稳定性好等技术特点,适用于谷物及制品中玉米赤霉烯酮的快速定量检测。     

荧光免疫层析检测牛奶中的生物素含量

以荧光微球作为新型标记物,采用EDC/NHS两步法偶联,制备荧光微球链霉亲合素复合物。复合物颗粒均一、性质稳定。以其作为探针,建立检测牛奶中生物素含量的荧光免疫层析法。本方法特异性良好,最低检出限低至3ng/m L,线性范围5 ng/m L~100 ng/m L,回收率90%~110%,精密度CV10%;与微生物法对比,测值相关系数为0.975。     

上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇

建立定量快速检测雌二醇(E2)的上转换免疫层析技术。以上转换发光材料(UCP)为新型标记物,采用戊二醛法偶联单克隆抗体(m Ab),制备UPT-m Ab复合物,并以其作为探针,基于小分子竞争结合,建立免疫层析试纸条方法,并对试纸条性能进行评价。方法特异性强,稳定性好,灵敏度高,最低检出限低至2.75 ng/m L,线性范围为5 ng/m L~2 000 ng/m L,回收率88.88%~103.5%,变异系数CV10%。成功构建了上转换免疫层析法用于检测雌二醇,适用于现场快速检测,具有良好的经济价值和应用前景。     

一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

本文以建立志贺氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法为目的。首先,制成志贺氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物,以双抗体夹心模式制备志贺氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测志贺氏菌。结果显示:用本研究建立的荧光纳米颗粒试纸条检测30株菌,对宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌呈阳性结果,其余菌株的呈阴性结果,试纸条灵敏度为9.0×104 CFU/m L。用志贺氏菌免疫层析试纸条和标准法检测60份样品,两种方法的总符合率为88.3%。结论:本研究成功建立了志贺氏菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测志贺氏菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的建立胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法。方法利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立金黄色葡萄球菌肠毒素B的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合检测曲线进行定量检测;在牛奶样品中添加金黄色葡萄球菌肠毒素B作为模拟污染样品进行检测。结果该法可在5～10min内完成定性和半定量检测,检出限为8ng/ml,线性范围8～1000ng/ml。结论建立的检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B,并可实现定量,适用于现场快速检测。     

荧光定量法快速检测鲜奶中四环素类总量残留

以荧光纳米微球标记抗体,建立免疫层析检测方法,配合荧光定量仪,可高灵敏度地检测样本中4种四环素类药物的残留含量,实现鲜奶中所含四环素类药物的总量检测。结果表明,本方法对四环素的检测下限达10μg/L,对金霉素、土霉素、多西环素回收率均达70%以上,除了与链霉素有0.32%的交叉反应率外,与其他药物没有交叉反应,整个检测过程只需15 min左右。通过建立的荧光定量免疫层析法,实现了四环素总量的快速定量检测。     

同时快速检测蔬菜中百菌清和多菌灵的胶体金免疫层析法

该研究制备分别特异性识别百菌清、多菌灵的两种单克隆抗体,并建立一种同时快速检测蔬菜中百菌清和多菌灵的胶体金免疫层析法。在最适工作条件下,所建立的方法对百菌清、多菌灵的检测限分别为0.08 ng/mL和1.95 ng/mL,线性范围分别为0.08～10.00 ng/mL和1.95～250.00 ng/mL。黄瓜、番茄、包菜3种样品加标回收率为79.2%～112.1%（百菌清）和63.3%～97.5%（多菌灵）,变异系数均低于18.9%,试纸条所需检测时间为20 min,可应用于蔬菜中百菌清、多菌灵残留的现场高通量快速筛查。     

基于群青蓝纳米粒子的免疫层析法快速检测牛奶中的黄曲霉毒素M1

目的 建立一种基于群青蓝纳米粒子的免疫层析法(immunochromatographic assay, ICA),用于快速检测黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)。方法 通过离心筛选出合适粒径的群青蓝纳米粒子,经羧基化修饰后与AFM1单克隆抗体通过碳二亚胺法共价偶联,制备免疫探针,用于AFM1检测。实验结果通过肉眼观察并结合Image J 软件进行定性定量分析,对所建立方法的灵敏度、特异性、准确性等进行评价。结果 经条件优化后,该方法定性视觉检测限为0.30 ng/mL,定量检测限(limit of detection, LOD)为0.051 ng/mL,与其他真菌毒素无交叉反应。结论 该方法可应用于牛奶样品中AFM1检测,检测结果符合国家限量标准,同时操作简单易于判断、特异性好,适用于现场快速初步筛查。     

High throughput detection of antibiotic residues in milk by time-resolved fluorescence immunochromatography based on QR code

ABSTRACT

Herein, we have successfully established a novel, rapid, and simple lateral-flow immunoassay based on time-resolved fluorescence and biotin-streptavidin to detect the residues of various antibiotics in milk. The fluorescence signal and sensitivity of immunochromatography were enhanced through biotinylated antibody coupled with streptavidin europium microspheres. Moreover, due to the use of a QR Code and fluorescent reader, quantitative detection and real-time data uploading can be achieved. Under the optimal conditions, the various antibiotic residues were detected in the milk samples. The results showed that the limits of detection of tylosin, lincomycin and doxycycline were 0.10, 0.06, and 0.27 ng/mL, respectively. The recoveries of the spiked milk samples were 88.9%~127%, with coefficients of variation less than 11%, and the test strip can be stored at room temperature for 12 months. This study shows that the proposed time-resolved fluorescence immunoassay is sensitive, rapid and reliable, and has the potential to be used for detection of veterinary antibiotic residues in food safety fields.     

胶体金免疫层析法定量检测鱼和虾中苯巴比妥残留

建立了一种快速定量检测水产品鱼和虾中苯巴比妥残留的胶体金免疫层析方法。采用胶体金纳米粒标记苯巴比妥单克隆抗体,研究了胶体金免疫层析条件如标记体系p H值、标记抗体浓度、检测T线包被原浓度、质控C线羊抗鼠Ig G浓度、样品前处理方法等对胶体金灵敏度的影响,并借助胶体金试纸条读数仪进行定量检测。结果表明:方法检出限为0.07 ng/mL,线性范围0.08～0.94ng/m L,裸眼消线值(cut-off值)为10.0 ng/mL。方法特异性良好,与巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥三种结构类似物交叉反应率小于10%。选择罗非鱼、草鱼、鲈鱼和虾进行添加回收试验,样品回收率在73.50%～114.17%之间,相对标准偏差小于15%,且结果与UPLC-MS/MS法一致。该方法具有准确、灵敏、简便、快速等特点,非常适用于水产品鱼和虾中苯巴比妥残留现场快速筛查。     

磁性荧光纳米颗粒标记免疫层析技术检测副溶血性弧菌热稳定直接溶血素的试验研究

目的通过抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒相结合的免疫层析技术,建立一种快速检测产热稳定直接溶血素(TDH)副溶血性弧菌的方法。方法构建产TDH副溶血性弧菌基因片段并进行扩增,扩增产物与质粒载体(p ET-28a)连接,并在大肠埃希菌中表达,制备抗体。抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒偶联后,制成免疫层析检测试纸条。将混有不同浓度标准菌株样品和阴性对照样品分别与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5min,紫外光下肉眼观察结果。对试验的敏感性、特异性、重复性进行测试并进行样品模拟试验。结果重组质粒载体在大肠埃希菌BL21(DE3)可稳定高效地表达分子量为26 k D的可溶形式的目的蛋白,并实现了单克隆抗体与磁性荧光颗粒很好的偶联,所得偶联物与最低浓度10 CFU/ml阳性菌株反应,阴性对照菌株无反应。结论试验制备的产TDH副溶血性弧菌毒力基因表达产物与磁性荧光纳米颗粒有机结合,检测操作过程简单,具有灵敏度高、特异性强、重复性好和检测时间短等特点。     

Surface Acoustic Wave (SAW) Biosensor for Rapid and Label-Free Detection of Penicillin G in Milk

Surface acoustic wave (SAW) biosensors were introduced for rapid and label-free detection of penicillin G in milk. This is the first time that the use of SAW biosensors for antibiotic detection is reported. Penicillin G belongs to the β-lactam antibiotics which are commonly used in human and veterinary medicine. Particularly because of the latter, the detection of antibiotics in foodstuffs of animal origin is essential. Current methods for specific antibiotic detection often require complex laboratory equipment and procedures. SAW biosensors, however, offer rapid detection of analyte concentrations with a minimum of experimental effort. They use label-free acoustic (gravimetric) detection. Owing to the small mass of antibiotics, detection via binding inhibition assay was preferred to direct detection in this work. Samples containing penicillin G were preincubated with the corresponding antibody, and SAW biosensor surfaces were coated with penicillin G epitopes. The antibody in the sample bound to the biosensor surface, unless it was inhibited by penicillin G. The assay allowed the detection of 2 ng/ml penicillin G in buffer and 2.2 ng/ml in low-fat milk. This is below the maximum residue limit of 4 ng/ml given by the European Commission for penicillin G and other β-lactam residues in food.     

高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原（DON-BSA）为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=－0.562x＋0.921,R2=0.990,IC50为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=－0.543x＋1.485,R2=0.991,IC50为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96 倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。     

Rapid on‐site determination of melamine in raw milk by an immunochromatographic strip

A rapid and simple method was established based on gold nanoparticle‐labelled monoclonal antibody probes for the detection of melamine pollution in raw milk. The conditions for conjugation between the antibody and gold nanoparticles were optimised (pH 8.0, antibody concentration 5 μg mL^?1). It gives a single proportional to melamine concentration with a performance time of only 3 min. A practical calibration curve was established with a reader system with limit of detection calculated as 4.47 and 8.34 μg L^?1 with naked eyes. Three structural analogues, atrazine, desethyl‐desisopropyl‐atrazine and cyromazine, were used to test the specificity of the immunochromatographic strip, and small colour changes on the strip test line were found even at the 500 ng mL^?1 spiked level. Fifty raw milk samples were detected with this strip method, and the resulting data coincided well with results from gas chromatography tandem mass spectrometry. The above‐mentioned results showed that this test strip can be used for melamine screening in the daily monitoring of milk.     

牛奶中β-内酰胺类和三聚氰胺检测方法的建立

建立一种快速、简便,同时针对牛奶中β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺残留的检测方法。应用竞争抑制免疫层析原理,研制β-内酰胺类和三聚氰胺胶体金试纸条。该试纸条检测限分别为青霉素G2μg/L、氨苄青霉素3μg/L、阿莫西林3μg/L、苯唑青霉素6μg/L、邻氯青霉素6μg/L、双氯青霉素6μg/L、萘夫西林20μg/L、头孢喹肟20μg/L、头孢哌酮40μg/L、头孢曲松50μg/L、头孢噻呋90μg/L、头孢洛宁10μg/L、三聚氰胺50μg/L,假阳性率低于5%、假阴性率为0,检测时间不超过15min。该方法操作简便、灵敏度高、特异性强,适用于乳品流通环节中β-内酰胺类抗生素和三聚氰胺残留的快速检测。     

胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究

本文应用胶体金免疫层析技术,建立了一种快速检测食品中黄曲霉毒素B1的方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗鼠抗驴分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/ml,检测时间为10min,批内和批间重复性为100%,假阳性率和假阴性率均为0。使用简单方便,非常适合现场快速检测黄曲霉毒素B1。     

上转换荧光猝灭试纸条检测牛奶中磺胺喹恶啉

目的:根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的原理,构建一种基于上转换荧光纳米材料的新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中的兽药磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline,SQX)残留。方法:通过热分解方法合成上转换纳米荧光材料,通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒。将合成的上转换荧光颗粒固定在试纸条C线上,并将上转换荧光颗粒与SQX包被抗原的混合物固定在T线上,将胶体金标记的SQX单克隆抗体喷涂在金标垫上。滴加样品后,随着样品液的流动,金标抗体会移动到T线处并与SQX包被抗原结合,这种结合会导致抗体上的纳米金颗粒(受体)与T线上的上转换颗粒靠近(供体),从而发生FRET,产生荧光猝灭。在980 nm激发器激发波长下通过目测检测荧光强弱变化,从而实现对SQX的检测。结果:该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1μg/L,牛奶样品的检测限为8μg/L。整个检测过程不超过15 min。结论:该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断,可以满足牛奶中SQX残留的现场快速检测的要求。